HLA-B27基因檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見(jiàn)稿）

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HLA-B27基因檢測試劑注冊審查指導原則（征求意見(jiàn)稿）

本指導原則旨在指導注冊申請人對人類(lèi)白細胞抗原B27（HLA-B27）基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)提供參考。

本指導原則是對HLA-B27基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則為注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

一、適用范圍

強直性脊柱炎是一種慢性炎性疾病，本病常發(fā)于青壯年男性，主要侵犯骶髂關(guān)節、脊柱骨突、脊柱旁軟組織和外周關(guān)節，可伴發(fā)前葡萄膜炎等關(guān)節外表現，嚴重者發(fā)生脊柱畸形和強直。

HLA-B27基因位于人類(lèi)第6號染色體短臂HLA基因B座，具有高度基因多態(tài)性，其表達產(chǎn)物為HLA-B27抗原。HLA-B27 抗原表達與強直性脊柱炎高度相關(guān)，超過(guò)90%的強直性脊柱炎患者的HLA?B27 抗原表達為陽(yáng)性，而普通人群中僅5% ~10% 為陽(yáng)性。HLA-B27在其他脊柱關(guān)節炎疾病中也有不同的檢出，在反應性關(guān)節炎中陽(yáng)性率可達60%-90%，在銀屑病關(guān)節炎和炎性腸病關(guān)節炎中陽(yáng)性率均可達50%-60%。

HLA-B27約有167個(gè)基因亞型，各亞型分布存在地域和人種差異。HLA-B*2705是全球分布最廣的亞型，被認為是其他基因亞型的祖基因。在中國漢族人群中，HLA-B*2704和HLA-B*2705是主要優(yōu)勢亞型，同時(shí)還存在HLA-B*2702、HLA-B*2703、HLA-B*2706、HLA-B*2707、HLA-B*2709。HLA-B*2702、HLA-B*2704、HLA-B*2705和HLA-B*2707是疾病易感基因，而HLA-B*2703、HLA-B*2706和HLA-B*2709與疾病的關(guān)系尚存在爭議。

本指導原則適用于基于熒光PCR法，定性檢測人靜脈全血樣本中的HLA-B27基因的試劑，用于強直性脊柱炎的輔助診斷。

對于采用其他分子生物學(xué)檢測方法（如基因測序法）或其他樣本類(lèi)型的檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內容不夠全面；申請人可參考本指導原則，同時(shí)依據產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)，對不適用部分闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導原則針對相關(guān)產(chǎn)品注冊申報資料中的部分內容進(jìn)行撰寫(xiě)，其他未盡事宜應當符合相關(guān)法規要求。

二、注冊審查要點(diǎn)

（一）監管信息

1.產(chǎn)品名稱(chēng)及分類(lèi)編碼

產(chǎn)品名稱(chēng)應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規的要求，同時(shí)建議申請人參考已上市同類(lèi)產(chǎn)品的產(chǎn)品名稱(chēng)。根據《體外診斷試劑分類(lèi)規則》，該產(chǎn)品按照第三類(lèi)體外診斷試劑管理，分類(lèi)編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表（應包含醫療器械唯一標識）、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監管機構的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內容。其中,產(chǎn)品描述應詳述技術(shù)原理、產(chǎn)品主要研究結果的總結和評價(jià)、與同類(lèi)和/或前代產(chǎn)品的比較等。與同類(lèi)和/或前代產(chǎn)品的比較應著(zhù)重從預期用途、技術(shù)原理、主要組成成分、性能指標、臨床應用情況等方面詳細說(shuō)明申報產(chǎn)品與已獲批準的同類(lèi)/前代產(chǎn)品之間的主要區別。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩定的前提下，根據產(chǎn)品研制、前期評價(jià)等結果，依據相關(guān)文件資料，結合產(chǎn)品特性按照《醫療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導原則》的要求編寫(xiě)。該類(lèi)產(chǎn)品作為第三類(lèi)體外診斷試劑，應當以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

第三類(lèi)體外診斷試劑應當提供三個(gè)不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗報告。目前已有適用的國家標準品發(fā)布，技術(shù)要求中應體現國家標準品的相關(guān)要求?？商峤灰韵氯我恍问降臋z驗報告：

（1）申請人出具的自檢報告。

（2）委托有資質(zhì)的醫療器械檢驗機構出具的檢驗報告。

如有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應不低于相應的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應提交在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有分析性能評估資料，包括具體試驗方案、試驗數據、統計分析結果及結論等詳細資料。有關(guān)試驗的背景信息也應在申報資料中進(jìn)行描述，包括試驗地點(diǎn)，采用的試劑名稱(chēng)、規格和批號，儀器名稱(chēng)和型號，樣本的背景信息（來(lái)源、樣本編號、樣本類(lèi)型、采集及處理方式、基因型和濃度確認方法及結果）等。分析性能評估用樣本應為真實(shí)樣本，如聲稱(chēng)多種適用樣本類(lèi)型，注冊申請人應針對不同樣本類(lèi)型分別完成性能評估研究。

分析性能評估的試驗方法可以參考國際或國內有關(guān)體外診斷試劑性能評估的指導原則進(jìn)行，對于本類(lèi)產(chǎn)品建議著(zhù)重對以下分析性能進(jìn)行研究。

2.1樣本穩定性及適用的樣本類(lèi)型

應充分考慮樣本采集/處理、運輸、保存等各環(huán)節的影響，確定樣本的保存條件及保存時(shí)間并對樣本穩定性進(jìn)行充分驗證。如樣本提取后不立即進(jìn)行檢測，則還需對提取后的DNA穩定性進(jìn)行充分研究。如聲稱(chēng)多種適用樣本類(lèi)型，注冊申請人應針對不同樣本類(lèi)型分別進(jìn)行樣本穩定性研究。

對于全血樣本，如適用多種抗凝劑，建議通過(guò)同源比對研究對一定數量的臨床樣本驗證各種抗凝劑的適用性。

2.2質(zhì)控品的賦值

描述質(zhì)控品的賦值過(guò)程，并提交三批產(chǎn)品在不同適用機型上的賦值研究資料。

2.3準確度

可通過(guò)申報產(chǎn)品與測序結果或已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行方法學(xué)比對研究，評價(jià)申報產(chǎn)品的準確度；也可通過(guò)檢測參考品（盤(pán)）分析申報產(chǎn)品檢測結果與經(jīng)確認結果的符合情況，評價(jià)申報產(chǎn)品的準確度。

評價(jià)準確度的樣本應由若干份臨床樣本組成，樣本類(lèi)型應與產(chǎn)品適用范圍一致，包含不同濃度水平。

2.4精密度

包括重復性、中間精密度和再現性。

精密度評價(jià)應采用真實(shí)樣本進(jìn)行研究，納入陰性樣本、弱陽(yáng)（檢出限附近）樣本和強陽(yáng)樣本。試驗操作應按照說(shuō)明書(shū)執行，需包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。

精密度評價(jià)需滿(mǎn)足如下要求：

2.4.1對可能影響檢測精密度的主要因素進(jìn)行驗證，除檢測試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還包括儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測輪次、試劑批次等。

2.4.2設定合理的精密度評價(jià)周期，并對批內/批間、日內/日間、不同操作者間和不同實(shí)驗室間的精密度進(jìn)行綜合評價(jià)。

2.4.3可結合產(chǎn)品的特點(diǎn)，對精密度指標評價(jià)標準做出合理要求，如CV值。

2.5最低檢出限和檢測上限

2.5.1最低檢出限和檢測上限的建立

最低檢出限為在滿(mǎn)足檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標基因的人基因組DNA最低濃度。
       可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行多次重復檢測，確定95%檢出率水平下的人基因組DNA最低濃度，即為最低檢出限。系列稀釋度應能夠覆蓋大部分檢出概率區間（0～100%），可根據各濃度梯度檢測結果直接判定，也可通過(guò)適當的模型（如Probit分析）和其他分析方法計算申報產(chǎn)品在設定概率下的檢出限，一般在該檢測濃度下應具有95%的檢出率。

同時(shí)，申請人亦應評價(jià)可準確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當檢出率水平下的人基因組DNA最高濃度。

應采用臨床樣本進(jìn)行檢出限及檢測上限研究。

2.5.2最低檢出限和檢測上限的驗證

選取與建立不同的臨床樣本進(jìn)行驗證，建議對最低檢出限和檢測上限附近濃度水平的樣本進(jìn)行至少20次的重復檢測，應滿(mǎn)足95%以上檢出率要求。

2.6 分析特異性

2.6.1干擾試驗

可通過(guò)在臨床樣本中添加干擾物質(zhì)的方式，評價(jià)添加前后干擾物質(zhì)對靶基因檢測的影響。研究用樣本應包含陰性樣本、弱陽(yáng)性樣本和中陽(yáng)性樣本（正常白細胞濃度水平樣本）。

建議注冊申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評價(jià)，如有干擾，應確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

應針對可能的內源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗研究。對于全血樣本，內源性干擾物質(zhì)應包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、白蛋白、；外源性干擾物質(zhì)應包括抗凝劑、乙醇、乙醛、預期人群常用治療藥物等如消炎痛、潑尼松、吡羅昔康、美洛昔康、 塞來(lái)昔布、 雙氯芬酸鈉、 吲哚美辛、 萘丁美酮、 布洛芬、 萘普生、柳氮磺胺吡啶等。

同時(shí)納入有代表性的患者樣本，通過(guò)對申報產(chǎn)品與不受該干擾物影響的測量方法檢測結果進(jìn)行對比，進(jìn)行干擾物質(zhì)研究。

2.6.2交叉反應

應對與靶基因序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的其他HLA基因的基因序列進(jìn)行交叉反應研究。

對于全血樣本，需提供血源性感染常見(jiàn)的病原體（如：乙肝、丙肝、HIV、梅毒）的交叉反應研究。

2.7 其他性能研究

2.7.1如申報產(chǎn)品的檢測靶標為具體基因亞型且不能分型，分析性能研究中應對申報產(chǎn)品聲稱(chēng)的每種基因亞型進(jìn)行研究和驗證。

2.7.2包容性研究

如申報產(chǎn)品的檢測靶標為HLA-B27基因，應證明申報試劑具有檢出不同HLA-B27亞型的能力。應至少包括中國人群已知常見(jiàn)亞型B2702、B2704、B2705、B2707等。

包容性研究應分別對上述常見(jiàn)亞型進(jìn)行精密度（重復性、中間精密度和再現性精密度）研究和最低檢出限的驗證。

2.8核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。

若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行精密度、檢出限和抗干擾的驗證。

2.9反應體系研究

2.9.1樣本采集和處理

請詳述樣本的采集及處理方式，明確樣本的保存介質(zhì)。

2.9.2反應體系

應依據產(chǎn)品特性，提供反應體系的確定研究資料。包括但不限于核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR反應中樣本和試劑的加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應條件（如：溫度、時(shí)間、循環(huán)數）等。

如有多個(gè)適用機型，需提供不同適用機型基線(xiàn)和閾值的確定資料。不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩定性研究

申請人可根據實(shí)際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的試驗方案、試驗數據、結果以及結論。

3.1實(shí)時(shí)穩定性研究

提交至少三批申報產(chǎn)品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。明確儲存的環(huán)境條件（如溫度、濕度和光照）及有效期。

3.2使用穩定性

提交申報產(chǎn)品實(shí)際使用期間穩定性的研究資料，應包括所有組成成分的開(kāi)封穩定性。適用時(shí)提交復溶穩定性、機載穩定性及凍融次數研究資料等。明確產(chǎn)品使用的溫度、濕度條件等。

3.3運輸穩定性

以文字結合圖示的方式詳細描述運輸包裝，明確產(chǎn)品實(shí)際運輸的環(huán)境條件（如溫度、濕度、光照和機械保護等）及暴露的最差運輸條件。提交申報產(chǎn)品可在特定或者預期的條件下運輸的研究資料。

4.陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值即為能夠獲得理想的檢測準確性的臨界值（Cut-off）。研究樣本應為預期使用人群的真實(shí)樣本，涵蓋中國人群常見(jiàn)HLA-B27亞型。樣本來(lái)源應具有地域和民族多樣性，考慮不同時(shí)間和生理/病理狀。

采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)的方式進(jìn)行研究，亦可采用其他科學(xué)合理的方法進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。

申請人應詳述試驗方案，列明所用試劑、儀器、對比方法、樣本量、樣本入組標準；提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括民族、性別、年齡、來(lái)源、唯一可溯源編號、臨床診斷信息等）及試驗結果等。

如果試劑判讀存在灰區，應解釋說(shuō)明灰區范圍的確定方法。

提供內標檢測結果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類(lèi)產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分、質(zhì)控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇、來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應提供詳細的制備過(guò)程及支持性資料；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠(chǎng)檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

5.1.1引物和探針

應詳述引物、探針的設計原則，提供引物探針序列、靶基因序列及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物探針以供篩選，針對待測位點(diǎn)的檢測靈敏度和特異性等進(jìn)行評價(jià)，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細的篩選研究數據。同時(shí)應針對引物、探針及檢測靶序列與公開(kāi)數據庫進(jìn)行同源性分析，如有同源序列應著(zhù)重評價(jià)是否會(huì )有交叉反應。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，一般包括：外觀(guān)、分子量、純度、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長(cháng)和發(fā)射波長(cháng)，以及功能性試驗等，并依據評價(jià)結果建立合理的質(zhì)量標準。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度、保存穩定性以及功能性試驗等資料，并確定質(zhì)量標準。

5.1.3酶

可能涉及到的酶包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、熱穩定性、功能性試驗等進(jìn)行評價(jià)和驗證，并確定質(zhì)量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內切酶活性，具熱穩定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內切酶活性。

5.1.4質(zhì)控品

選擇檢測范圍內一種或多種亞型制備陽(yáng)性質(zhì)控品，同時(shí)設置不含待測靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控。

HLA-B基因存在個(gè)體差異，并非所有人體均具有HLA-B27，因此試劑盒中需另外設置內標對照。

質(zhì)控體系應能夠對檢測全過(guò)程進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽(yáng)性結果。質(zhì)控品可采用臨床樣本核酸提取液或細胞系等?？瞻踪|(zhì)控品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應針對質(zhì)控品原料來(lái)源、選擇、制備、定值過(guò)程等提供詳細的研究資料，并對質(zhì)控品的檢測結果做出明確的范圍要求。

5.1.5  內標

內標，又稱(chēng)內對照，可對管內抑制導致的陰性結果進(jìn)行質(zhì)量控制，應與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內標的引物、探針設計和相關(guān)反應體系的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內標的檢測結果Ct值范圍。建議科學(xué)設置內標，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應體系進(jìn)行監控。

5.1.6核酸提取/純化試劑（如有）

應提供試劑的主要組成、原理介紹及相關(guān)的篩選及驗證資料。

5.1.7企業(yè)參考品

該類(lèi)產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。企業(yè)參考品應為真實(shí)樣本，且應根據產(chǎn)品特點(diǎn)和性能驗證的實(shí)際需要進(jìn)行設置。

應提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、濃度及基因亞型確認方法或試劑等相關(guān)研究資料。企業(yè)參考品的設置建議如下：

陽(yáng)性參考品應包含可檢出的各HLA-B27亞型，且應設置不同濃度水平。

陰性參考品應考慮檢測特異性的評價(jià)，納入同源序列交叉反應樣本、干擾樣本、HLA-B27陰性樣本等。

檢出限參考品的設置與陽(yáng)性參考品相同，濃度水平應包括最低檢出限濃度或略高于最低檢出限濃度。

精密度參考品至少包括HLA-B2704和HLA-B2705；每個(gè)亞型包括高、低兩個(gè)濃度水平，其中一個(gè)濃度應為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

該類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝研究資料主要包括工作液配制（引物探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干、熒光標記等工藝過(guò)程的描述及確定依據。

生產(chǎn)過(guò)程應對關(guān)鍵參數進(jìn)行有效控制，可結合工藝流程圖描述生產(chǎn)工藝過(guò)程，明確關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。并提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價(jià)資料

臨床試驗的開(kāi)展、方案的制定以及報告的撰寫(xiě)等均應符合相關(guān)法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》（國家藥品監督管理局通告2021年第72號）的要求，如相關(guān)法規、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。

1.臨床試驗機構

應選擇至少3家（含3家）已備案的臨床試驗機構，按照相關(guān)法規的要求開(kāi)展臨床試驗。申請人應根據產(chǎn)品特點(diǎn)及預期用途，綜合不同地區人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗機構。臨床試驗機構應具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節，熟悉臨床試驗方案。

2.臨床試驗方法

如申報產(chǎn)品已有同類(lèi)產(chǎn)品上市，建議申請人選擇境內已批準上市的同類(lèi)產(chǎn)品作為對比試劑/方法，采用申報產(chǎn)品與之進(jìn)行對比試驗研究，評價(jià)申報產(chǎn)品的臨床性能。對比試劑的選擇應從預期用途、樣本要求、檢測性能等方面，確認其與申報產(chǎn)品具有較好的可比性。如對比試劑不可分型，還應選擇臨床參考方法（如：一代測序）對臨床試驗中的陽(yáng)性樣本進(jìn)行分型，確認申報產(chǎn)品所聲稱(chēng)的基因亞型均被驗證。

3.受試者選擇和樣本類(lèi)型

3.1受試者選擇

受試者應為強直性脊柱炎疑似患者，應具有相關(guān)疑似癥狀或體征等，如：炎性腰背痛、外周關(guān)節炎和足趾炎等；臨床試驗還應納入部分需要鑒別診斷的其他患者，如：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎和系統性紅斑狼瘡的患者等癥狀相似人群。

3.2 樣本類(lèi)型

適用的樣本類(lèi)型一般為靜脈全血。臨床試驗應納入臨床原始樣本，不應直接采用提取的基因組DNA進(jìn)行試驗。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應同時(shí)滿(mǎn)足申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以及對比試劑說(shuō)明書(shū)（如適用）的相關(guān)要求。

4.臨床試驗樣本量

臨床試驗樣本量應滿(mǎn)足統計學(xué)要求，可采用適當的統計學(xué)方法進(jìn)行估算，同時(shí)應滿(mǎn)足法規最低樣本量的要求。

建議采用單組目標值法進(jìn)行樣本量估算。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的臨床可接受標準（P0）建議均不低于95%。當評價(jià)指標PT接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統計學(xué)分析，如精確概率法等。

上述公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著(zhù)性水平和把握度的標準正態(tài)分布的分數位，P0為評價(jià)指標的臨床可接受標準，PT為申報產(chǎn)品評價(jià)指標預期值。

臨床試驗總體樣本量確定時(shí)應在上述陽(yáng)、陰性樣本最低樣本量估算的基礎上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應樣本等情況適當增加入組樣本量.

如申報產(chǎn)品的檢測靶標為具體基因亞型且不能分型，臨床試驗應對申報產(chǎn)品聲稱(chēng)的每種基因亞型進(jìn)行驗證，每種基因亞型均應有一定的陽(yáng)性例數。

如申報產(chǎn)品的檢測靶標為HLA-B27基因，臨床試驗至少應對常見(jiàn)基因亞型進(jìn)行驗證，至少應驗證HLA-2704、HLA-2705、HLA-2702和HLA-2707等,每種基因亞型均應具有一定的陽(yáng)性例數。

 5.統計學(xué)分析

應對入組人群進(jìn)行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。應總結各基因亞型的例數，以2×2表分別總結兩種試劑的定性檢測結果，并分別計算陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率及其95%置信區間。對于可分型的試劑，應以2×2表分別總結兩種試劑不同基因亞型的定性檢測結果，并分別計算不同基因亞型的符合率和總符合率及其95%置信區間。

在數據收集過(guò)程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用合理方法進(jìn)行復核，并對差異原因進(jìn)行分析。如無(wú)需復核，應說(shuō)明理由。

6.倫理學(xué)要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準則。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風(fēng)險，提請倫理委員會(huì )審查，并獲得倫理委員會(huì )的同意。注冊申報時(shí)應提交倫理委員會(huì )的審查意見(jiàn)。

7.臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗過(guò)程中遵循預定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗過(guò)程應在臨床試驗機構的實(shí)驗室內并由本實(shí)驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實(shí)驗進(jìn)程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗操作過(guò)程和結果判定時(shí)應采用盲法以保證試驗結果的客觀(guān)性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進(jìn)行合理的統計學(xué)分析。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗開(kāi)始前，建議進(jìn)行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個(gè)試驗過(guò)程都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及精密度。

9.臨床試驗報告撰寫(xiě)

臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應該對整個(gè)臨床試驗實(shí)施過(guò)程、結果分析、結論等進(jìn)行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法，最后得出臨床試驗結論。臨床試驗報告的撰寫(xiě)參考《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導原則》的相關(guān)要求。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)格式應符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的技術(shù)內容應與注冊申報資料中的相關(guān)研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，應以規范格式對此內容進(jìn)行標注，并單獨注明文獻的相關(guān)信息。

以下內容僅對HLA-B27基因檢測試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內容進(jìn)行詳細說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)其他內容應根據《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》要求進(jìn)行編寫(xiě)。

1.【預期用途】 應至少包括以下幾部分內容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人體靜脈外周血樣本中的HLA-B27基因。

1.2介紹被測基因與臨床適用癥的關(guān)系，明確HLA-B27在中國人群中的分布頻率，在臨床適用癥人群中的發(fā)生頻率。

1.3明確本產(chǎn)品檢測結果僅供臨床參考，臨床醫生應結合患者病情、療效及其他實(shí)驗室檢測指標等對本產(chǎn)品的檢測結果進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對被測靶基因在HLA-B基因中的區域位置，片段大小、保守與否等進(jìn)行詳細描述，對試劑盒所用探針、引物、陽(yáng)性結果的判定方式等進(jìn)行詳細的介紹；明確內標基因的名稱(chēng)及其作用。對不同樣本反應管組合、質(zhì)控品設置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行介紹。

2.2如反應體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分的名稱(chēng)、數量和裝量。

明確各組分中的引物、探針、酶、dNTP、緩沖液名稱(chēng)、防腐劑名稱(chēng)。

明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱(chēng)、注冊人，貨號及注冊證號。

明確不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

4.【檢驗方法】

詳細說(shuō)明試驗操作的各個(gè)步驟，包括：

4.1試驗條件：必要時(shí)，應明確實(shí)驗室分區、試驗環(huán)境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

4.2試劑配制方法和注意事項。

4.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項，列明全血樣本用量、洗脫體積等；對核酸提取純化環(huán)節進(jìn)行合理的質(zhì)量控制，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

4.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

4.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設置、循環(huán)數設置或相應的自動(dòng)化檢測程序及相關(guān)注意事項。

4.6儀器設置：特殊參數、探針的熒光素標記情況、各熒光通道選擇等。

5.【陽(yáng)性判斷值】

明確靶基因和內標基因的陽(yáng)性判斷值，簡(jiǎn)要說(shuō)明建立和驗證陽(yáng)性判斷值的基本信息，包括樣本量、人群特征（民族、性別、年齡、生理/病理狀態(tài)等）和采用的統計學(xué)方法。

6.【檢驗結果的解釋】

以列表形式詳述所有可能出現的結果及相應的解釋。

7.【檢驗方法的局限性】

7.1列明可檢測的HLA-B27亞型，明確其他亞型未進(jìn)行驗證。

7.2明確可能出現的交叉反應。列明可檢出的同源序列、其他HLA基因等。

7.3有關(guān)假陰性結果的可能性分析。

7.3.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導致假陰性結果。

7.3.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì )導致假陰性結果（如有）。

7.4 明確是否可區分HLA-B27雜合或純合。

7.5明確正常人群中也可表達HLA-B27，臨床使用中應結合檢測結果、其他癥狀/體征、病史、實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

8.【產(chǎn)品性能指標】

8.1符合國家標準品的情況。

8.2準確度研究方案和結果。

8.3精密度研究的總結，包括實(shí)驗方案、樣本量、各樣濃度水平、不精密度考慮因素（時(shí)間、地點(diǎn)和人員等）。

8.4最低檢出限。明確可檢出DNA濃度水平范圍。

8.5干擾研究結果。明確各內源和外源性干擾物對檢測結果不產(chǎn)生影響的最高濃度。

8.6交叉反應研究結果。明確納入研究的同源序列/HLA基因是否存在交叉反應。

8.7 包容性研究總結。明確可檢出的亞型。

8.8臨床試驗總結。

9.【注意事項】應至少包括以下內容：

9.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應給出具有潛在感染性的警告。

9.2臨床實(shí)驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實(shí)驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗室、臨床基因擴增實(shí)驗室的管理規范執行。

（六）質(zhì)量管理體系文件

申請人應當在申請注冊時(shí)提交與產(chǎn)品研制、生產(chǎn)有關(guān)的質(zhì)量管理體系相關(guān)資料。詳述產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程，提供生產(chǎn)工藝流程圖。明確申報產(chǎn)品反應及檢測原理和過(guò)程，標明主要控制點(diǎn)與項目及主要原材料、采購件的來(lái)源及質(zhì)量控制方法。

如適用，應當提供擬核查產(chǎn)品與既往已通過(guò)核查產(chǎn)品在生產(chǎn)條件、生產(chǎn)工藝等方面的對比說(shuō)明。