發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（食藥監辦械函[2013]3號）

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發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則
（食藥監辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導原則主要針對發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節提出指導性技術(shù)要求。

本指導原則系對發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學(xué)依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內容也將進(jìn)行適時(shí)的調整。

二、適用范圍

該指導原則主要適用于利用發(fā)光免疫分析技術(shù)對蛋白質(zhì)等被測物質(zhì)進(jìn)行檢測的第三類(lèi)體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查，第二類(lèi)試劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制可參考該指導原則執行

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料應當制定相應的質(zhì)量標準，并符合有關(guān)法規的要求。

2.診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應具備相應的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、儀器設備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫療器械生產(chǎn)許可證》;同時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細則（試行）》的要求建立相應的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運行;生產(chǎn)企業(yè)還應該通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。企業(yè)應對試劑的使用范圍做出明確規定，并經(jīng)國家藥品監督管理部門(mén)批準。

3.診斷試劑的研制應當按照科學(xué)、規范的原則組織研發(fā)，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學(xué)原理。

4.研制生產(chǎn)過(guò)程中所用的材料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.試劑生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標：保證產(chǎn)品使用安全，質(zhì)量穩定，工藝可控，使用有效。

（二）原材料質(zhì)量控制

1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類(lèi)、激素類(lèi)等生物原科。這類(lèi)原料可用于包被酶標反應板、標記相關(guān)酶（辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應用抗原或抗體、制備校準品（標準品）等。一般按工藝要求對這類(lèi)生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規定的質(zhì)量標準。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩定;若購買(mǎi)，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關(guān)法規的要求進(jìn)行變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：

（1）外觀(guān)

肉眼觀(guān)察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色雜質(zhì);特殊生物原料應具備相應外觀(guān)標準。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳。一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質(zhì)量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過(guò)Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進(jìn)行檢測。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過(guò)倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應達到規定的要求。

（5）功能性實(shí)驗

功能性實(shí)驗是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過(guò)程中作為蛋白保護劑用途的一類(lèi)生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標準應符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》規定的標準要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外觀(guān)：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無(wú)溶血或異物

無(wú)菌試驗：將血清直接37℃度放置7天，放在明亮處觀(guān)察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外觀(guān)：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無(wú)吸潮，無(wú)結塊，無(wú)肉眼可見(jiàn)的其他雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃時(shí)，溶解時(shí)間應不大于15分鐘。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值應為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲方測定，質(zhì)量標準為≥95%。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量，其標準為≥90%。

（3）酪蛋白：

酸度應符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。

（4）標記用酶

應在產(chǎn)品的質(zhì)量標準中明示所使用的標記用酶的名稱(chēng)（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應根據不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的檢驗方法和質(zhì)量標準進(jìn)行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進(jìn)行功能性實(shí)驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行測定，均不得出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標準，包括外觀(guān)、一般鹽類(lèi)檢測、溶液pH值、重金屬檢測、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

（1）無(wú)機類(lèi)：主要包括有氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氯鈉等。

（2）有機類(lèi)：主要包括有吐溫20、三羥基氨基甲烷等。

（3）特殊化學(xué)原料：銪-DTTA，魯米諾等。

銪-DTTA純度分析與鑒定：要求銪-DTTA各功能團符合分子結構，純度在96%以上。

4.其他原輔料

（1）微孔板條

外觀(guān)：明亮處用肉眼觀(guān)察板條的外觀(guān)質(zhì)量應無(wú)劃痕、破損、飛邊、骯臟、表面光滑。板條與微孔反應條塑料框架應配合合適。

材質(zhì)：微孔反應板條每孔加200μL增強液，用發(fā)光免疫分析儀檢測其熒光值，平均本底熒光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定濃度的蛋白包被微孔板條，檢測熒光值，CV值結果應符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標準，一般批內CV≤5%,批間CV≤10%。

（2）其他

粘膠紙、鋁箔袋、說(shuō)明書(shū)、包裝外盒、瓶子和干燥劑等應參照國家食品藥品監督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》和《醫療器械說(shuō)明書(shū)、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質(zhì)量控制標準。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

發(fā)光免疫分析試劑主要組分的生產(chǎn)包括包被反應板、標記物制備、各種溶液的配置、凍干、分包裝等步驟;并通過(guò)產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個(gè)質(zhì)控過(guò)程來(lái)保證其質(zhì)量符合規定。

1.固相載體的制備（因不同產(chǎn)品使用的包被載體有很大區別，在此以標準96孔微孔反應板為例進(jìn)行描述）

（1）包被板的準備

準備經(jīng)檢驗合格的包被板，記錄批號、數目、狀態(tài)標識。

質(zhì)控項目：尺寸、外觀(guān)、包裝。

（2）包被液的配制

配制包被緩沖液，加入包被的抗體或抗原至工作濃度，混合均勻，即成所需的包被液，工作濃度的包被液應在規定時(shí)間內使用。

質(zhì)控項目：包被緩沖液配方、pH值、包被物成分。

（3）包被板的包被

包被液按工藝要求加入包被板。記錄所包被的包被板數量。

質(zhì)控項目：包被體積、溫度、時(shí)間、過(guò)程監控。

（4）洗板工作液的配制（按各單位工藝要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

質(zhì)控項目：洗板工作液配方、pH值。

（5）封閉液的配制

按配方配制封閉液。

質(zhì)控項目：封閉液配方、pH值。

（6）洗板和封閉

包被完成后，抽去孔內包被液，用洗板工作液洗板后（按各單位工藝要求，可以不洗板），加入封閉液。

質(zhì)控項目：封閉體積、溫度、時(shí)間、過(guò)程監控。

質(zhì)檢項目：封閉前檢驗包被均一性。

（7）抽干

封閉后的反應板，抽干孔內液體。

質(zhì)控項目：過(guò)程監控。

（8）干燥

反應板應按工藝的要求進(jìn)行干燥。

質(zhì)控項目：溫度、濕度、時(shí)間、過(guò)程監控等。

（9）密封包裝

將干燥后的反應板用鋁箔袋密封包裝，內放干燥劑（按各單位工藝要求，可以不放）。

質(zhì)控項目：密封性能、標示及效期等。

（10）反應板（半成品）檢驗

對裝袋密封后的反應板進(jìn)行抽樣檢驗，外觀(guān)、板內變異、板間變異。

2.滴配過(guò)程

（1）酶結合物的制備（根據各產(chǎn)品實(shí)際情況，該步驟可不進(jìn)行）

采用常規過(guò)碘酸鈉——乙二醇法將相關(guān)的抗體（或抗原）標記辣根過(guò)氧化物酶（或其他酶），酶標記后的抗體（或抗原）應加入適當的保護劑保存于低溫。

質(zhì)控項目：標記方法、過(guò)程控制。

（2）酶結合物的鑒定

①功能性實(shí)驗

將酶結合物用酶稀釋液稀釋后，用于產(chǎn)品的滴配，其結果應符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標準。

② 穩定性

將酶結合物用酶稀釋液稀釋?zhuān)M(jìn)行2~8℃熱穩定性實(shí)驗，滴配結果應符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標準。

（3）酶結合物稀釋液

按酶結合物稀釋液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于規定時(shí)間內使用。

質(zhì)控項目：酶結合物稀釋液配方、pH值。

（4）酶結合物工作濃度的滴配

取酶結合物，用酶結合物稀釋液稀釋到不同的濃度，用已制備好的反應板進(jìn)行滴配。測定系列標準品及相應的質(zhì)控品，確定使體系達到最優(yōu)的酶結合物工作濃度。

（5）酶結合物工作液配制

將所需量酶結合物和酶結合物稀釋液按滴配濃度混合均勻。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，用配套的反應板進(jìn)行檢驗，外觀(guān)、靈敏度、質(zhì)控品測定值、定量產(chǎn)品應作校準品線(xiàn)性檢測。

（6）酶結合物工作液的分裝

按工藝要求分裝酶結合物工作液。

質(zhì)控項目：分裝前確認試劑名稱(chēng)、批號、數量，分裝量，封裝后密封性。

（7）酶結合物工作液（半成品）檢驗

對分裝后的酶結合物工作液進(jìn)行抽樣檢驗，外觀(guān)、分裝量、靈敏度、校準品劑量-反應曲線(xiàn)線(xiàn)性、質(zhì)控品測定值。

3. 校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品的制備

（1）稀釋液

按稀釋液的配方配制，存放在2~8℃或-20℃保存，并于有效期內使用。

質(zhì)控項目：稀釋液配方、pH值。

（2）校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品的配制

校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品的配制應具有量值溯源性，可參照國家標準品、世界衛生組織標準品或其他級別的標準物質(zhì)進(jìn)行配制。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，準確性、劑量-反應曲線(xiàn)線(xiàn)性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測定值。

（3）校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品的分裝

按工藝要求分裝校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品。

質(zhì)控項目：分裝前確認試劑名稱(chēng)、批號、數量，分裝量。

（4）校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品（半成品）檢驗

對分裝后的校準品、陰/陽(yáng)性對照或質(zhì)控品進(jìn)行抽樣檢驗，外觀(guān)、分裝量、準確性、劑量-反應曲線(xiàn)線(xiàn)性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測定值。

4.化學(xué)發(fā)光底物的制備

（1）底物緩沖液

按底物緩沖液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于有效期內使用。

質(zhì)控項目：底物緩沖液配方、pH值。

（2）化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的配制

分別按氧化劑和發(fā)光劑的配方在底物緩沖液中加入相應的氧化劑和發(fā)光劑

質(zhì)控項目：氧化劑和發(fā)光劑配方。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，本底、發(fā)光強度。

（3）化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的分裝

按工藝要求分裝化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）。

質(zhì)控項目：分裝前確認試劑名稱(chēng)、批號、數量，分裝量，封裝后密封性。

（4）化學(xué)發(fā)光底物（半成品）檢驗

對分裝后的化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行抽樣檢驗，外觀(guān)、分裝量、本底、靈敏度、發(fā)光強度。

5.銪標記物的制備

針對不同的標記生物原料，確定不同的標記制備工藝，包括銪-DTTA與標記生物原料的比例，標記溫度和標記時(shí)間、標記得率的計算標準等。在實(shí)際操作過(guò)程中要求嚴格按照標準操作規程進(jìn)行操作

6.凍干

各種凍干品都需建立各自的凍干工藝，凍干品外觀(guān)應該呈現疏松的粉末狀固體，具有一定的形狀，復溶完全、迅速，呈澄清透明液體。

7.分裝、燈檢和貼簽

分裝量用減重稱(chēng)量法進(jìn)行測量，把質(zhì)量換算成體積后進(jìn)行分裝量的控制。燈檢是目測檢查各組分的色澤、分裝量以及是否混濁、有雜質(zhì)等。

8.包裝

根據試劑盒包裝標準操作規程及說(shuō)明書(shū)的要求，以流水線(xiàn)操作形式進(jìn)行包裝。包裝時(shí)應嚴格檢查品名、批號、裝量，認真核對各物料數量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復核。

（四）質(zhì)量控制

1.半成品質(zhì)量控制

（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據抽樣申請單抽取規定數量的半成品各組分，作號標記、待檢。

（2）質(zhì)控品的要求

用于半成品質(zhì)量控制的質(zhì)控品包括陰/陽(yáng)性樣品符合率、靈敏度（最低檢出量）、特異性、檢測范圍、定量曲線(xiàn)的線(xiàn)性、精密性、穩定性等指標，如具有國家標準品或參考品的產(chǎn)品應使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化的企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗。如無(wú)國家標準品（參考品），可采用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監督管理局已經(jīng)批準的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

（3）半成品檢驗

根據各個(gè)試劑盒的企業(yè)標準或者制檢規程進(jìn)行半成品的檢驗，檢驗指標一般包括準確性、靈敏度、特異性、精密性、相關(guān)性等，均應達到相應的質(zhì)量標準。

企業(yè)應對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩定性研究。試劑盒各組分應留樣，2~8℃定期作穩定性考核，同時(shí)作37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

2.成品質(zhì)量控制

（1）成品抽樣

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據試劑的批號、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫(xiě)抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質(zhì)檢人員同時(shí)應檢查相關(guān)原始記錄。

每一批發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑的試生產(chǎn)量應滿(mǎn)足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（2）成品檢驗

一般使用國家標準品（參考品）對成品進(jìn)行檢驗，并達到國家標準品（參考品）的質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒(méi)有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監督管理局已經(jīng)批準的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

在批放行前，每一批發(fā)光類(lèi)診斷試劑應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

四、名詞解釋

發(fā)光免疫類(lèi)檢測試劑：根據特異性抗原抗體反應等生物學(xué)原理，利用發(fā)光信號的強弱對樣本中相應抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測的一類(lèi)試劑。主要包括化學(xué)發(fā)光（酶促、非酶促），電化學(xué)發(fā)光和時(shí)間分辨熒光等法。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社