生物芯片類(lèi)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（食藥監辦械函[2013]3號）

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生物芯片類(lèi)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則
（食藥監辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導原則主要針對生物芯片類(lèi)檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節提出指導性技術(shù)要求。

本指導原則系對生物芯片類(lèi)檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學(xué)依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內容也將進(jìn)行適時(shí)的調整。

二、適用范圍

根據芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分為核酸芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片等。本指導原則是針對核酸和蛋白為檢測靶分子生物芯片的注冊技術(shù)審查指導原則，其他類(lèi)型靶分子檢測的芯片診斷試劑可參考本指導原則。

三、基本要求

（一）基本原則

1.試劑研制、生產(chǎn)用各種原料、輔料等應制定相應的質(zhì)量標準，并符合有關(guān)法規的要求。

2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應具備相應的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、儀器設備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫療器械生產(chǎn)許可證》;同時(shí)，應按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細則（試行）》的要求建立相應的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運行;還應通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

3.生物芯片類(lèi)試劑在研制時(shí)，應當按照科學(xué)、規范的原則組織研發(fā)，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑研制、生產(chǎn)過(guò)程中所用的物料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質(zhì)量控制

1.核酸檢測芯片

核酸芯片檢測時(shí)，從生物樣本中提取的核酸可用熒光標記、金標記和酶標記;檢測方法包括光譜學(xué)方法和化學(xué)顯色。下面為熒光標記芯片技術(shù)指導原則，采用金標記和酶聯(lián)顯色等的生物芯片診斷試劑可參照核酸芯片和蛋白芯片相關(guān)部分。

（1）主要生物原料

核酸檢測芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探針、標記物等。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩定，企業(yè)應按照工藝要求對這類(lèi)生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規定的質(zhì)量標準;若購買(mǎi)，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，同時(shí)，供應商應提供相應的質(zhì)量保證證明和相應的質(zhì)檢報告，達到生產(chǎn)規定的質(zhì)量標準。如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關(guān)法規的要求進(jìn)行變更申請。

①模板DNA

重組DNA：經(jīng)測序驗證，關(guān)鍵堿基或序列沒(méi)有錯誤。1×TE溶解，濃度為100ng/μl以上，-20℃保存。作為陽(yáng)性參考品時(shí)，其稀釋度由企業(yè)根據產(chǎn)品標準確定。

②dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）

HPLC純，PCR級，無(wú)DNase、RNase污染，-20℃以下保存。

③引物

生產(chǎn)中的引物原材料為凍干粉，PAGE純或HPLC純。用標準DNA模板擴增，電泳檢測，譜帶單一，大小正確，與對照引物比較，產(chǎn)物量一致。符合視為合格引物，-20℃以下保存。

④探針（用于陣列制備）

重組DNA, 凍干粉（或1×TE溶解液）：至少滿(mǎn)足一個(gè)批次的用量，酶切鑒定分析圖譜。

PCR產(chǎn)物，凍干粉（或1×TE溶解液）：至少滿(mǎn)足一個(gè)批次的用量，PCR電泳鑒定圖譜。

合成寡核苷酸：PAGE純或HPLC純，至少滿(mǎn)足一個(gè)批次的用量，提供該產(chǎn)品的PAGE電泳分析圖譜或HPLC分析圖譜。

探針序列的正確性：應用克隆鑒定的標準DNA雜交鑒定或測序鑒定。

純度和濃度檢測：采用電泳方法，電泳圖譜沒(méi)有雜帶，目的條帶的強度與已知濃度的標準DNA條帶進(jìn)行參比計算其強度。純度較高的DNA，可用紫外分光光度計進(jìn)行定量。檢驗合格后入庫，避光、-20℃以下保存。

⑤標記物

含有激發(fā)光波長(cháng)和發(fā)射光波長(cháng)介于280~680nm的所有熒光分子，HPLC純。

⑥Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 檢測，純度＞95%，具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內切酶活性;具熱穩定性，94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。產(chǎn)品-20℃保存。

⑦尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具尿嘧啶糖基化酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內切酶活性。1U UNG 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板被降解后不能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。產(chǎn)品-20℃保存。

⑧逆轉錄（RT）酶

具有逆轉錄活性，無(wú)核酸內切酶活性，-20℃保存。

⑨RT-PCR酶

具逆轉錄酶活性和DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內切酶活性，具熱穩定性，94℃ 1小時(shí)后仍保持50%活性。產(chǎn)品-20℃保存。

⑩緩沖液

各類(lèi)酶制品所需的反應緩沖液由廠(chǎng)家隨酶制品提供，-20℃保存。

（2）主要生物輔料

主要生物輔料包括酶類(lèi)（蛋白酶、核酸酶等）、核酸提取試劑、魚(yú)精DNA、封閉用蛋白、雜交液等，企業(yè)應建立相應的質(zhì)量標準。主要生物輔料若為企業(yè)自己生產(chǎn)（配制），其工藝必須相對穩定，并按照工藝要求對這類(lèi)生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規定的質(zhì)量標準;若購買(mǎi)，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，同時(shí)，供應商應提供相應的質(zhì)量保證證明和相應的質(zhì)檢報告，達到生產(chǎn)規定的質(zhì)量標準。

（3）主要化學(xué)原輔料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標準參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準（2000年版）》分析純級別進(jìn)行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀(guān)、一般鹽類(lèi)檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。

主要化學(xué)原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)檢報告，其質(zhì)量標準應達到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。

（4）其他物料

①載玻片

外觀(guān)：明亮處用肉眼觀(guān)察無(wú)缺刻，無(wú)劃傷等。規格按設計要求。

激光掃描儀掃描（波長(cháng)為芯片檢測波長(cháng)）：包被層基本均勻。

②試管、吸頭、試劑瓶等

一次性使用，由生產(chǎn)廠(chǎng)家提供質(zhì)量保證，達到設計要求。

③其他：

包括試劑瓶標簽、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說(shuō)明書(shū)、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》和《醫療器械說(shuō)明書(shū)、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質(zhì)量標準。

2.蛋白檢測芯片

（1）主要生物原料

與生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類(lèi)生物原科。這類(lèi)原料可用于點(diǎn)膜、標記相關(guān)酶、納米金、光學(xué)基團及中和反應用抗原或抗體等。使用前應按照工藝要求對這類(lèi)生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達到規定的質(zhì)量標準。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩定;若購買(mǎi)，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關(guān)法規的要求變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：

①外觀(guān)

肉眼觀(guān)察，大部分生物原料為澄清均一液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色雜質(zhì);特殊生物原料應具備相應外觀(guān)標準。

②純度和分子量

生物原料經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析;也可用其他適宜的方法，如高效液相法等進(jìn)行分析。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳。一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg;電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質(zhì)量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。

③蛋白濃度

蛋白濃度可通過(guò)Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜方法進(jìn)行檢測。

④效價(jià)

效價(jià)的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過(guò)倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應達到規定的要求。

⑤功能性實(shí)驗

功能性實(shí)驗是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

（2）主要生物輔料

生物輔料是指在生產(chǎn)過(guò)程中作為蛋白保護劑用途的一類(lèi)生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標準應符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準（2000年版）》規定的質(zhì)量標準要求，并且要適合于企業(yè)生產(chǎn)。

建議作以下檢驗：

①牛血清或羊血清

外觀(guān)：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無(wú)溶血或異物

無(wú)菌試驗：將血清直接37℃放置7天，放在明亮處觀(guān)察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，標準為不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀。沉淀溶于0.85%NaCl溶液至1ml，用Lowry法測定蛋白含量不能大于2mg/ml。

②牛血清白蛋白：

外觀(guān)：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無(wú)吸潮，無(wú)結塊，無(wú)肉眼可見(jiàn)的其他雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解時(shí)間在18~26℃時(shí)應不大于15分鐘。pH值應為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，其標準為不小于干重的95%。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為不小于總蛋白含量的95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為不小于90%。

③酪蛋白：

應符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。

④標記用酶

應在產(chǎn)品的質(zhì)量標準中明示所使用的標記用酶的名稱(chēng)（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應根據不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的檢驗方法和質(zhì)量標準進(jìn)行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進(jìn)行功能性實(shí)驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行測定，均不得出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

（3）化學(xué)原輔料

參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準（2000年版）》分析純級別進(jìn)行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀(guān)、一般鹽類(lèi)、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。

主要化學(xué)原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)檢報告，其質(zhì)量標準應達到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標準。

（4）其他物料

①基質(zhì)

以硝酸纖維素膜為例：孔徑符合設計要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛細遷移速度±20%）、尺寸（與標識吻合）

②試劑瓶和干燥劑

由生產(chǎn)廠(chǎng)家提供質(zhì)量保證，達到規定要求。

③其他：說(shuō)明書(shū)、包裝外盒等

應參照國家食品藥品監督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》和《醫療器械說(shuō)明書(shū)、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質(zhì)量控制標準，如數量、規格等。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、組織芯片和細胞芯片等。生物芯片診斷試劑產(chǎn)品基本可分成二個(gè)部分，一部分是芯片，另一部分檢測用工作液。如果有配套的檢測儀器，還需對儀器及處理軟件的應用加以說(shuō)明。

1.芯片的生產(chǎn)

芯片生產(chǎn)的基本過(guò)程包括探針的獲取方法，純化，點(diǎn)樣，固定。

（1）探針獲取

不同芯片，主要是探針不同，生物芯片的探針主要包括以下幾類(lèi)，其他探針可參考制定相應的技術(shù)及質(zhì)量標準。

①DNA探針的獲取

探針的形式包括PCR產(chǎn)物、克隆DNA、人工合成DNA片段等;要求有生產(chǎn)程序和質(zhì)量指標及檢測方法，要進(jìn)行純化，有固定的純化程序。

②抗原的生產(chǎn)

抗原獲得方法包括細胞培養、從生物材料中分離提取、基因工程表達以及合成肽等?；蚬こ瘫磉_產(chǎn)物又分為純抗原蛋白、融合蛋白等。

③抗體

抗體分單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w制備包括細胞培養，動(dòng)物腹水，基因工程表達等方式。

④細胞和組織

包括細胞或組織類(lèi)型，固定方法。組織材料包括固定，包埋，切片等。

（2）陣列的排列設計

陣列的排列可以是依次排列、隨機排列、對角線(xiàn)排列以及其他排列方式，但設計時(shí)需考慮重復次數和對照等因素。

（3）點(diǎn)陣的制作

使用儀器的需要確定型號，程序;手工制作的也應有標準操作程序。

（4）固定：包括固定方式，固定條件等。

應對芯片生產(chǎn)的過(guò)程進(jìn)行相應的質(zhì)量控制，如點(diǎn)樣和固定過(guò)程的監控、點(diǎn)樣均一性檢驗等。

2.工作液配制

（1）芯片生產(chǎn)所需試劑，包括細胞培養基，探針制備試劑，陣列制作和固定試劑等。

（2）樣品處理試劑，芯片檢測靶分子分為核酸和蛋白質(zhì)。檢測核酸的樣品處理試劑包括臨床取樣、DNA提取或RNA提取試劑，逆轉錄試劑，PCR擴增試劑，核酸標記試劑等;檢測蛋白的處理試劑包括取樣試劑，蛋白稀釋液以及特殊試劑等。

（3）反應液：檢測核酸時(shí)的反應液包括預雜交液、雜交液、洗脫液等;檢測蛋白時(shí)，包括封閉液、抗原/抗體反應液、洗脫液、顯色液、顯色終止液等。

3.數據判讀

（1）判斷標準及依據，包括Cut off值的確定依據。

（2）數據判讀方式：人工還是軟件判讀。

（3）如果是軟件判讀，應提供軟件判斷的科學(xué)依據（包括生物學(xué)原理、數據獲取原理和判斷實(shí)驗是否成立的依據）以及實(shí)驗測試的原始報告（或數據），并需要說(shuō)明：

①軟件的來(lái)源：購買(mǎi)或自己編制，是否獲得注冊等。

②軟件的用途：包括對數據的分析、存儲、解讀、含義等。

③軟件的使用：基本的使用程序。

（四）半成品質(zhì)量控制

1.抽樣

檢驗人員按批號抽取檢驗需要數量的半成品，做好標記，待檢。

2.半成品檢驗

利用上一批檢驗合格的試劑盒的相應組分，對本批生產(chǎn)出的各種試劑盒組分分別進(jìn)行檢驗，檢驗結果達到產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品進(jìn)行。若某類(lèi)試劑沒(méi)有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監督管理局已經(jīng)批準的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢測所抽樣的半成品試劑盒的性能，包括陰/陽(yáng)性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應質(zhì)量標準的要求。精密性評價(jià)應采用比最低檢測限高一個(gè)數量級的質(zhì)控品，重復檢測10次，判定結果一致。對定量檢測試劑，同時(shí)應分析其線(xiàn)性相關(guān)系數和定量質(zhì)控品檢測結果的準確性。

企業(yè)應該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩定性測試。穩定性試驗可在特定溫度或特定條件下完成。對蛋白芯片，應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產(chǎn)品的質(zhì)量標準。

（五）成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據試劑的批號、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫(xiě)抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質(zhì)檢人員同時(shí)應檢查相關(guān)原始記錄。

每一批生物芯片類(lèi)檢測試劑的試生產(chǎn)量應滿(mǎn)足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

1.成品檢驗

一般使用國家標準品（參考品）或經(jīng)國家標準品（參考品）標化后的企業(yè)參考品進(jìn)行。若某類(lèi)試劑沒(méi)有國家標準品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應有規范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應不低于國家食品藥品監督管理局已經(jīng)批準的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

2.穩定性試驗

試劑批放行前，應完成穩定性試驗。穩定性試驗可在特定溫度或特定條件下完成。對蛋白芯片，每批試劑批放行前，應完成37℃熱穩定性試驗，達到相應的質(zhì)量標準。

四、名詞解釋

生物芯片類(lèi)檢測試劑：本指導原則所定義的生物芯片檢測試劑是指將多個(gè)生物探針（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗體，組織，細胞等）按預先設計的排列方式固定在特制的基質(zhì)（包括玻璃片，尼龍膜，硝酸纖維素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并進(jìn)行標記，然后與固定在基質(zhì)上的生物探針特異性的結合，再用相應的檢測設備（如激光掃描儀、CCD檢測儀等）和分析方法（包括軟件）進(jìn)行檢測、記錄、分析，實(shí)現對生物靶分子的定性或定量檢測的試劑。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社