基于高通量測序技術(shù)的非小細胞肺癌相關(guān)基因變異檢測試劑臨床試驗注冊審查指導原則（2024年第4號）

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基于高通量測序技術(shù)的非小細胞肺癌相關(guān)基因變異檢測試劑臨床試驗注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對基于高通量測序技術(shù)的非小細胞肺癌相關(guān)基因變異檢測試劑臨床試驗的設計及開(kāi)展，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是針對基于高通量測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術(shù)的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC）相關(guān)基因變異檢測試劑臨床評價(jià)的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學(xué)合理性進(jìn)行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

一、適用范圍

本指導原則所闡述的基于NGS技術(shù)的NSCLC基因變異檢測試劑，是指采用NGS技術(shù)檢測NSCLC患者10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本中的基因變異狀態(tài)的體外診斷試劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“申報產(chǎn)品”）。

本指導原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和變更注冊的產(chǎn)品。

有關(guān)此類(lèi)產(chǎn)品的背景信息參見(jiàn)附件。

二、臨床試驗設計

（一）臨床性能研究

1.臨床試驗機構及人員

申請人應選擇不少于3家按要求備案的臨床試驗機構開(kāi)展臨床試驗。臨床試驗機構應常規開(kāi)展NSCLC分子病理檢測，具有病理診斷、分子生物學(xué)等檢測的優(yōu)勢，試驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。臨床試驗整個(gè)過(guò)程均應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

2.臨床試驗適用人群和樣本類(lèi)型

適用人群為經(jīng)病理診斷為NSCLC的人群。應注意納入NSCLC不同分期的病例，同時(shí)應納入不同的組織分型（包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌以及大細胞癌等）。陽(yáng)性樣本應包括不同突變率的樣本。

臨床試驗所用的樣本類(lèi)型應為FFPE樣本。如對于穿刺標本及手術(shù)標本均適用，則臨床試驗中對于兩種標本均應納入。臨床樣本的處理、保存和核酸提取等應分別滿(mǎn)足申報產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)及對比試劑說(shuō)明書(shū)的相關(guān)要求。

3.對比方法的選擇

可選擇實(shí)驗室參考方法或已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對比方法。參考方法的檢測可在臨床試驗機構完成也可委托具有資質(zhì)的第三方機構完成。對比方法的選擇應從預期用途、樣本要求、檢測性能、檢測范圍、所檢突變是否可以分型等方面，確認其與申報產(chǎn)品具有較好的可比性。也可以采用多種對比方法來(lái)分別進(jìn)行對比。

4.最低樣本量

臨床試驗樣本量應采用適當的統計學(xué)方法進(jìn)行估算，并詳細描述所使用統計方法及各參數的確定依據。此部分臨床試驗目的為評估兩種檢測方法之間的一致性，因此建議采用單組目標值法進(jìn)行最低樣本量的估算。通過(guò)陽(yáng)性符合率和陰性符合率來(lái)分別計算所需陽(yáng)性樣本和陰性樣本的例數，應針對每個(gè)基因分別進(jìn)行樣本量的估算。

陰、陽(yáng)性符合率的臨床可接受標準（P0）建議不低于90%。

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著(zhù)性水平和把握度的標準正態(tài)分布的分數位，P0為評價(jià)指標的臨床可接受標準，PT為申報產(chǎn)品評價(jià)指標預期值。

應對申報產(chǎn)品所聲稱(chēng)的每個(gè)基因的各種突變均進(jìn)行驗證，且每種突變類(lèi)型均應具有一定例數。對于臨床發(fā)生率較低的突變，可結合申報產(chǎn)品的檢測原理（如是否共用相同的引物及捕獲探針等）及申報產(chǎn)品的整體檢測性能等綜合考慮。對于融合和插入/缺失，應覆蓋常見(jiàn)的變異亞型。

臨床試驗總樣本量確定時(shí)應在上述陰、陽(yáng)性樣本最低樣本量估算的基礎上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及申報產(chǎn)品所覆蓋的突變位點(diǎn)，根據實(shí)際情況適當增加入組樣本量。

5.統計分析

首先應針對所入組人群進(jìn)行人口學(xué)分析，包括性別、年齡、治療狀態(tài)、組織分型、分期、樣本類(lèi)型（穿刺標本或手術(shù)標本）、腫瘤細胞含量、覆蓋所有基因亞組等方面進(jìn)行分析，還應分析臨床試驗中所納入的陽(yáng)性判斷值附近的樣本情況。

以四格表分別總結申報產(chǎn)品與對比方法的定性檢測結果，計算陽(yáng)性符合率、陰性符合率及相應的95%置信區間。除總體統計外，還要針對每個(gè)基因、每種突變進(jìn)行統計分析，以驗證申報產(chǎn)品與對比方法檢測結果的一致性。

對于融合和插入/缺失，應分別統計每種融合或插入/缺失亞型的例數，常見(jiàn)的變異亞型應有一定例數。

同時(shí)應針對存在混合突變的樣本單獨進(jìn)行統計分析。

針對兩種方法檢測不一致樣本，應采用合理的方法進(jìn)行確認，對不一致的原因綜合進(jìn)行分析。

（二）臨床意義的確認

1.具有明確伴隨診斷意義的基因變異

針對具有明確伴隨診斷意義的基因變異，如EGFR （19del、L858R、T790M）、ALK融合、ROS1融合、MET 14外顯子跳躍突變、RET融合、BRAF V600E等，應參考伴隨診斷相關(guān)指導原則提供伴隨診斷臨床證據。申請人應關(guān)注國內相關(guān)靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的批準情況，針對國內已有相關(guān)抗腫瘤藥物上市的基因變異靶點(diǎn)，應提供伴隨診斷臨床證據。

1.1 一致性比對

針對EGFR、ALK融合、ROS1融合、BRAF V600E，如申報產(chǎn)品為針對已上市的抗腫瘤藥物所開(kāi)發(fā)的非原研伴隨診斷試劑，則可按照相關(guān)指導原則的要求，采用與原研伴隨診斷試劑進(jìn)行一致性比對的方式開(kāi)展臨床試驗，也可采用指導原則中的其他評價(jià)路徑。

1.1.1臨床試驗機構的數量

針對此部分臨床研究，申請人應選擇不少于3家按要求備案的臨床試驗機構開(kāi)展臨床試驗。

1.1.2對比方法的選擇

應選用申報產(chǎn)品所聲稱(chēng)伴隨的抗腫瘤藥物的原研伴隨診斷試劑作為對比試劑。應注意，申報產(chǎn)品所聲稱(chēng)的基因變異位點(diǎn)應與原研伴隨診斷試劑具有一致性，超出原研伴隨診斷試劑檢測范圍的突變位點(diǎn)不可作為指導用藥的依據或提供伴隨診斷意義的臨床證據。

申報產(chǎn)品用于指導用藥的靈敏度應與原研伴隨診斷試劑相當，根據原研伴隨診斷試劑的靈敏度水平設置相應的陽(yáng)性判斷值，以保證兩者具有較好的一致性。

1.1.3入組人群

此部分臨床研究的目的在于評價(jià)申報產(chǎn)品的伴隨診斷的預期用途，因此所入組人群應以申報產(chǎn)品所聲稱(chēng)的伴隨的抗腫瘤藥物的適應證人群為主。如藥物的適應證人群臨床上較少，客觀(guān)上無(wú)法實(shí)現，則臨床試驗中也應包含一部分藥物的適應證人群。

1.1.4 樣本量要求

樣本量的估算方法與上述臨床性能評價(jià)中的樣本量估算方法相同，根據與原研伴隨診斷試劑的一致性水平設置合理的最低可接受標準。如原研伴隨診斷試劑同時(shí)能夠滿(mǎn)足對申報產(chǎn)品臨床性能的評價(jià)，則此部分研究可與第一部分臨床性能的評價(jià)進(jìn)行合并，但應注意入組人群的差異。

如采用與原研伴隨診斷試劑的外部等效性研究進(jìn)行伴隨診斷用途的驗證，應采用合理的統計學(xué)模型進(jìn)行樣本量的估算，樣本量應能夠滿(mǎn)足申報產(chǎn)品和原研伴隨診斷試劑檢測結果之間的符合率非劣效于兩次原研伴隨診斷試劑檢測結果之間的符合率的要求。應注意在統計分析過(guò)程中非劣效性界值的確定應能夠滿(mǎn)足臨床需求，并提供非劣效界值的確定依據。

此部分研究中應根據適應證人群中的基因突變率納入臨床常見(jiàn)的變異類(lèi)型。

1.1.5 統計分析

此部分研究的目的在于評價(jià)申報產(chǎn)品與原研伴隨診斷試劑在適應證人群中篩選人群的一致性，因此除了應按照不同突變（如EGFR 19del、L858R）進(jìn)行統計分析外，還應對申報產(chǎn)品與原研伴隨診斷試劑對用于篩選人群的生物標志物的不同突變匯總統計（EGFR 19del+L858R）。

如伴隨診斷用途的驗證采用與原研伴隨診斷試劑進(jìn)行比較的外部等效性研究的評價(jià)方法，應采用特定的統計學(xué)方法進(jìn)行統計分析，即：評價(jià)同時(shí)與原研伴隨診斷試劑的第一次檢測結果相比，申報產(chǎn)品和原研伴隨診斷試劑的第二次檢測結果的陽(yáng)性符合率的差值和陰性符合率的差值的95%置信區間上限是否小于預先設定的非劣效界值。

1.2 橋接試驗及藥物療效觀(guān)察性研究

對于MET 14外顯子跳躍突變、RET融合等目前國內已有相應的抗腫瘤藥物上市的基因變異，按照伴隨診斷相關(guān)指導原則的要求，目前尚不能進(jìn)行一致性比對的路徑提供伴隨證據，可選擇橋接試驗或藥物療效觀(guān)察性研究的路徑進(jìn)行伴隨診斷意義的驗證。

1.3 與抗腫瘤藥物同步研發(fā)的伴隨診斷試劑

如申報產(chǎn)品為與新開(kāi)發(fā)的抗腫瘤藥物同步研發(fā)的伴隨診斷試劑，則可提供與藥物同步開(kāi)發(fā)的藥物臨床試驗資料作為其伴隨診斷證據。藥物臨床試驗報告中應明確所使用的伴隨診斷試劑為申報產(chǎn)品，并明確申報產(chǎn)品在藥物臨床試驗中所起的作用以及與藥物療效的關(guān)系。

2. 具有臨床意義的基因變異

基于NGS方法的檢測能力及技術(shù)特點(diǎn)，對于尚不是伴隨診斷的基因變異位點(diǎn)，但經(jīng)臨床診療指南公認為具有臨床意義的基因變異亦可以納入其檢測范圍。

針對此類(lèi)基因變異，對于有已上市同類(lèi)產(chǎn)品的，無(wú)需提供其臨床意義的證據。如尚無(wú)已上市同類(lèi)產(chǎn)品的，申請人應提供針對NSCLC患者的臨床診療指南等臨床公認的相關(guān)資料作為該類(lèi)基因變異位點(diǎn)臨床意義的支持性資料。

（三）通用要求

1.臨床試驗方案

臨床試驗實(shí)施前，研究人員應從流行病學(xué)、統計學(xué)、臨床醫學(xué)、檢驗醫學(xué)等多方面考慮，設計科學(xué)合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構應執行同一臨床試驗方案，且保證在整個(gè)臨床試驗過(guò)程中遵循預定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗過(guò)程應在臨床試驗機構的實(shí)驗室內并由本實(shí)驗室的技術(shù)人員操作完成，申請人的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實(shí)驗進(jìn)程，尤其是數據收集過(guò)程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被剔除出臨床試驗都應記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗操作過(guò)程中和判定試驗結果時(shí)應采用盲法以保證試驗結果的客觀(guān)性。

2.質(zhì)量控制

臨床試驗開(kāi)始前，建議進(jìn)行臨床試驗方案的培訓，以熟悉并掌握相關(guān)試驗方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗誤差。整個(gè)試驗過(guò)程都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗報告

臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應該對整個(gè)臨床試驗實(shí)施過(guò)程、結果分析、結論等進(jìn)行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法，最后得出臨床試驗結論。臨床試驗報告的撰寫(xiě)應參考相關(guān)法規的要求。

報告中應明確所配套使用的測序儀、生物信息數據分析軟件、測序試劑等具體信息。

數據匯總表中應提供唯一可溯源的樣本編號、基本人口學(xué)信息（性別、年齡等）、臨床診斷背景信息、腫瘤的組織分型、分期、組織樣本腫瘤細胞占比、突變類(lèi)型、突變頻率、測序深度、覆蓋該位點(diǎn)的整個(gè)測序深度的測序數據（reads數）、申報產(chǎn)品及對比方法的檢測結果等信息。

委托第三方機構進(jìn)行參考方法檢測的，應提供臨床試驗機構委托第三方機構的委托協(xié)議。同時(shí)應提供參考方法的詳細資料，如：方法原理、所需試劑及儀器、參考方法的性能驗證、參考方法質(zhì)控、典型的實(shí)驗圖譜及數據等。上述資料應由臨床試驗機構簽章確認。

三、參考文獻

[1] NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines?) Non-Small Cell Lung Cancer, Version 3.2023.

[2]中國臨床腫瘤學(xué)會(huì )（CSCO）非小細胞肺癌診療指南 2023.

[3]中國臨床腫瘤學(xué)會(huì )非小細胞肺癌專(zhuān)家委員會(huì )，二代測序技術(shù)在NSCLC中的臨床應用中國專(zhuān)家共識（2020版）[J].中國肺癌雜志,2020,23(9):741-761.

[4]中華醫學(xué)會(huì )病理學(xué)分會(huì )等，非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實(shí)踐指南（2021版）[J].中華病理學(xué)雜志,2021,50(4):323-332.

[5]國家藥品監督管理局.抗腫瘤藥物的非原研伴隨診斷試劑臨床試驗注冊審查指導原則:國家藥監局通告2021年第95號[Z].

[6]國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心.與抗腫瘤藥物同步研發(fā)的原研伴隨診斷試劑臨床試驗注冊審查指導原則:國家藥品監督管理局醫療器械技術(shù)審評中心2022年第28號[Z].

附件

關(guān)于基于高通量測序技術(shù)的非小細胞肺癌

相關(guān)基因變異檢測試劑的背景介紹

基于高通量測序（high-throughput sequencing）即下一代測序（next generation sequencing，NGS）的技術(shù)，檢測腫瘤組織中的基因變異，正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)領(lǐng)域。腫瘤基因變異類(lèi)型包括點(diǎn)突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數異常等。尤其精準醫療的蓬勃發(fā)展，在抗腫瘤藥物的伴隨診斷領(lǐng)域也起到了至關(guān)重要的作用。

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，按照病理學(xué)分類(lèi)，可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）兩種類(lèi)型，其中NSCLC是最為常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，約占85%。隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對于NSCLC的認識已經(jīng)從組織水平發(fā)展到了分子水平，越來(lái)越多的腫瘤相關(guān)基因變異被發(fā)現，基于基因變異的靶向治療在NSCLC的抗腫瘤治療中起到了顯著(zhù)的臨床效果。目前在NSCLC中的腫瘤相關(guān)突變基因主要有以下基因：

EGFR：人表皮生長(cháng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）突變是NSCLC驅動(dòng)基因研究中最早發(fā)現的基因變異，也是NSCLC中最常見(jiàn)的驅動(dòng)基因變異。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與癌細胞增殖、轉移和凋亡等多種信號傳導通路有關(guān)。EGFR突變率在亞洲人群晚期肺腺癌患者中的發(fā)生率高達50%，該基因的常見(jiàn)突變位點(diǎn)發(fā)生在18號～21號外顯子上，其中最常見(jiàn)的是19號外顯子缺失突變（19del）以及21號外顯子L858點(diǎn)突變（L858R），這兩種突變占比約為90%，均為EGFR酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI）敏感型突變。20號外顯子上的T790M替代突變?yōu)橐淮鶷KI的耐藥突變。此外，還有許多類(lèi)型的突變臨床意義尚不明確。

ALK：間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK）基因融合在NSCLC中的發(fā)生率約為5%~10%，其中EML4是最常見(jiàn)的ALK融合伴侶，占ALK 重排的90%~95%。EML4-ALK又分為多個(gè)亞型，其中V1型（E13:A20）和V3型（E6:A20）占比最高，約占EML4-ALK融合突變的75%~80%，其次為V2型（E20:A20），其他EML4-ALK融合亞型則較為少見(jiàn)（占比均不足10%）。ALK靶向抑制劑對ALK基因融合陽(yáng)性的晚期NSCLC患者具有顯著(zhù)療效。除EML4這一最常見(jiàn)的融合伴侶外，研究還發(fā)現KIF5B、TFG、KLC1、SOCS5、HIP1、TPR、BIRC6等多種罕見(jiàn)的ALK融合伴侶，這些罕見(jiàn)的融合并未有充分的藥物研究。

ROS1：ROS1位于人類(lèi)6號染色體長(cháng)臂上，全稱(chēng)c-ros原癌基因，是跨膜酪氨酸激酶受體家族成員之一。發(fā)生融合的ROS1蛋白失去了大部分細胞外結構域，不需要配體結合便可被持續激活，導致下游信號通路功能異常。ROS1融合在NSCLC中的發(fā)生率約為2%，重排位點(diǎn)主要發(fā)生在32號~36號外顯子，最常見(jiàn)的ROS1融合伴侶是CD74、SLC34A2、CCDC6和FIG。臨床上作為克唑替尼等藥物的檢測靶點(diǎn)。

MET：c-MET為一種表達于上皮細胞和內皮細胞表面的受體酪氨酸激酶，可被其配體干細胞生長(cháng)因子（HGF）激活，在腫瘤細胞的生長(cháng)、增殖、侵襲及抑制細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。c-MET通路異常激活主要包括MET 14號外顯子跳躍突變、MET擴增和MET蛋白過(guò)表達3種類(lèi)型。目前已有針對MET 14號外顯子跳躍突變晚期NSCLC患者的靶向藥物獲得批準，并且有多個(gè)新藥已處于臨床研究階段。

RET：RET原癌基因位于第10號染色體長(cháng)臂，編碼一種具有酪氨酸激酶活性的單次跨膜糖蛋白受體。RET激酶受體可通過(guò)細胞內酪氨酸殘基的自磷酸化激活，觸發(fā)包括RAS-MARK、PI3K-AKT、JAK-STAT等于細胞增殖及存活相關(guān)的信號通路。RET基因變異主要有兩種形式，點(diǎn)突變及基因融合。RET基因融合常見(jiàn)于NSCLC，在NSCLC中的發(fā)生率約為1.4%~2.5%，其中KIF5B-RET為最常見(jiàn)的RET融合，約占68.3%，其次為CCDC6-RET（16.8%）、NCOA4-RET（1.2%）。RET融合基因為靶向藥物的研發(fā)提供了靶點(diǎn)，目前國內已有針對NSCLC的RET抑制劑獲批上市。

BRAF：BRAF突變可導致MAPK/ERK信號通路異?；罨?，在NSCLC中突變頻率為1%~2%，常見(jiàn)突變位型為V600E，約占50%以上。目前國內已有針對NSCLC的BRAF抑制劑獲批上市。

KRAS：KRAS在亞洲人群中突變率為8%~10%，突變位點(diǎn)位于2號及3號外顯子。研究表明，由于重疊靶向變異的可能性較低，KRAS中存在已知激活突變可以幫助識別出不太可能因進(jìn)一步分子檢測受益的患者。

ERBB2（HER2）：HER2是酪氨酸激酶受體ERBB家族成員之一，在NSCLC中最常見(jiàn)的突變是20號外顯子插入突變，在NSCLC中的突變率為2%~4%。研究顯示，小分子TKI對HER2突變型的晚期NSCLC患者的療效不佳。

基于NGS技術(shù)高通量的特點(diǎn)，并且可檢測的變異類(lèi)型多樣, 隨著(zhù)研究的深入，會(huì )有越來(lái)越多的具有臨床意義的基因變異被發(fā)現。目前在NCCN及我國相關(guān)非小細胞肺癌診療指南中推薦檢測的主要為以上基因變異，考慮到中國NSCLC患者特有的基因變異頻率、藥物在中國的獲批適應證及藥物可及性，CSCO NSCLC診療指南（2023）中對不可手術(shù)的晚期NSCLC患者，檢測分子標志物EGFR突變、ALK融合、ROS1融合、RET融合、MET 14外顯子跳躍突變、BRAF V600突變、NTRK融合作為Ⅰ級推薦。相關(guān)的專(zhuān)家共識中亦建議至少應同時(shí)檢測EGFR突變、ALK融合和ROS1融合三種形式的基因變異。