北京藥監印發(fā)《北京市醫療器械無(wú)菌檢驗檢查要點(diǎn)指南（2023版）》

北京市藥品監督管理局關(guān)于印發(fā)《北京市醫療器械無(wú)菌檢驗檢查要點(diǎn)指南（2023版）》的通知

發(fā)布時(shí)間：2023年12月08日

京藥監發(fā)〔2023〕277號

各區市場(chǎng)監管局，房山區燕山市場(chǎng)監管分局，市市場(chǎng)監管局機場(chǎng)分局，北京經(jīng)濟技術(shù)開(kāi)發(fā)區管理委員會(huì )商務(wù)金融局，市藥監局各分局，各相關(guān)事業(yè)單位：

為深入貫徹落實(shí)醫療器械生產(chǎn)監管相關(guān)法規要求，進(jìn)一步規范北京市醫療器械生產(chǎn)監督檢查工作，持續強化醫療器械生產(chǎn)科學(xué)監管，市藥監局組織對《醫療器械無(wú)菌試驗檢查要點(diǎn)指南（2010版）》進(jìn)行了修訂，形成《北京市醫療器械無(wú)菌檢驗檢查要點(diǎn)指南（2023版）》，現印發(fā)給你們，請參照執行。

特此通知。

北京市藥品監督管理局

2023年12月6日

附件：北京市醫療器械無(wú)菌檢驗檢查要點(diǎn)指南（2023版）

北京市醫療器械無(wú)菌檢驗檢查
要點(diǎn)指南（2023版）

無(wú)菌檢驗是無(wú)菌醫療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過(guò)程中的一項重要內容。其檢驗方法、檢驗結果判定及檢驗人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無(wú)菌醫療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無(wú)菌檢驗工作應由本企業(yè)獨立完成。

本指南旨在幫助北京市醫療器械生產(chǎn)監管人員增強對無(wú)菌檢驗重要性的認識、加強對無(wú)菌檢驗相關(guān)知識的掌握，指導和規范全市醫療器械生產(chǎn)監管人員對醫療器械生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗過(guò)程控制水平的監督檢查工作，同時(shí)，為醫療器械注冊人、備案人、受托生產(chǎn)企業(yè)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“生產(chǎn)企業(yè)”）在無(wú)菌檢驗的過(guò)程管理要求提供參考和依據。

本指南中涉及或引用的國家相關(guān)法律、法規、規章、標準、檢查指南等發(fā)生內容或效力變化時(shí)，要以當時(shí)執行的最新版為準。必要時(shí)，北京市藥品監督管理局應重新研究修訂，以確保本指南持續符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市藥品監督管理局組織、實(shí)施醫療器械注冊質(zhì)量管理體系現場(chǎng)核查、醫療器械生產(chǎn)許可現場(chǎng)核查、醫療器械生產(chǎn)監督檢查等涉及無(wú)菌檢驗檢查的參考資料。

二、檢查內容

檢查人員應在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗活動(dòng)的情況下，對其無(wú)菌檢驗過(guò)程的控制情況進(jìn)行全面的檢查并對其控制水平作出客觀(guān)的評價(jià)。

一般情況下，檢查人員可按照以下順序開(kāi)展檢查工作，并適時(shí)做好相關(guān)記錄：

1．了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無(wú)菌檢驗方法。常見(jiàn)的產(chǎn)品無(wú)菌檢驗方法包括直接接種法和薄膜過(guò)濾法。當建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢驗方法時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應進(jìn)行方法適用性試驗，以證明所采用的方法能夠給出正確的結果。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結果時(shí)，應重新進(jìn)行方法適用性試驗。方法適用性試驗應按供試品無(wú)菌檢驗的規定及有關(guān)要求進(jìn)行操作，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性和對微生物無(wú)毒性。應對藥典規定的每一試驗菌逐一進(jìn)行方法確認。方法適用性試驗也可與供試品的無(wú)菌檢驗同時(shí)進(jìn)行。

2．了解檢驗人員的專(zhuān)業(yè)背景、培訓情況及工作經(jīng)歷?？赏ㄟ^(guò)查看學(xué)歷證書(shū)、培訓證書(shū)或當面詢(xún)問(wèn)檢驗人員等方式，檢查無(wú)菌檢驗人員是否具備微生物專(zhuān)業(yè)知識，是否經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)的專(zhuān)業(yè)培訓以及是否具有相應的檢驗工作經(jīng)驗等。

3．現場(chǎng)查看無(wú)菌實(shí)驗室。無(wú)菌檢驗應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內（如在10000級潔凈間內配置超凈工作臺等）進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴格遵守無(wú)菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區、工作臺面及環(huán)境應定期監測。

4．現場(chǎng)查看無(wú)菌檢驗所需的設備和器具。其中，主要設備包括：恒溫培養箱（真菌、細菌）和（或）恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器和（或）電熱干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過(guò)濾裝置（無(wú)油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；從試驗安全性考慮，建議陽(yáng)性對照試驗使用生物安全柜。

主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75%乙醇棉、滅菌刻度吸管（1mL）、滅菌平皿（9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。

生產(chǎn)企業(yè)應采用可靠方法對與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器內121℃、30分鐘，或置電熱干燥箱內160℃、2小時(shí)。器具滅菌后必須做好標識，標明滅菌的時(shí)間和使用有效期。器皿在滅菌后，應在經(jīng)驗證的保存期內使用。

5．對照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無(wú)菌檢驗的管理制度、操作規程等相關(guān)技術(shù)文件，要求檢驗人員當場(chǎng)操作或口述無(wú)菌檢驗的過(guò)程。

（1）培養基制備

生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規定的脫水培養基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養基應保存在2℃～25℃、避光的環(huán)境，并在經(jīng)驗證的保存期內使用。

生產(chǎn)企業(yè)也可以使用商品化的預制培養基，應在規定的有效期內使用。

無(wú)菌檢驗用的硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基等應符合培養基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無(wú)菌檢驗前或與供試品的無(wú)菌檢驗同時(shí)進(jìn)行。

（2）供試品的無(wú)菌檢驗

無(wú)菌檢驗方法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，對于醫療器械類(lèi)產(chǎn)品，應優(yōu)先采用直接接種法。進(jìn)行供試品無(wú)菌檢驗時(shí)，應進(jìn)行方法適用性試驗。供試品無(wú)菌檢驗所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。

無(wú)菌操作時(shí)，如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材（如帶有除菌過(guò)濾器的針頭）向容器內導入無(wú)菌空氣，再按無(wú)菌操作啟開(kāi)容器取出內容物。

（3）培養及觀(guān)察

含培養基的容器按規定的溫度培養不少于14天。培養期間應定期觀(guān)察并記錄是否有菌生長(cháng)。如在加入供試品后、或在培養過(guò)程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀(guān)上判斷有無(wú)微生物生長(cháng)，可取該培養液不少于1mL轉種至同種新鮮培養基中，將原始培養物和新接種的培養物繼續培養不少于4天，觀(guān)察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁；或取培養液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

（4）結果判斷

生產(chǎn)企業(yè)應按照如下標準進(jìn)行判斷：

①若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(cháng)，判供試品符合規定；②若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(cháng)，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無(wú)效，即生長(cháng)的微生物非供試品所含。陽(yáng)性對照管應生長(cháng)良好，陰性對照管不得有菌生長(cháng)，否則試驗無(wú)效。

當符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗結果無(wú)效：①無(wú)菌檢驗試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監控結果不符合無(wú)菌檢驗方法的要求；②回顧無(wú)菌檢驗過(guò)程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素；③供試品管中生長(cháng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌檢驗中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當引起的。

試驗若經(jīng)確認無(wú)效，應重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無(wú)菌生長(cháng)，判供試品符合規定；若有菌生長(cháng)，判供試品不符合規定。

6．查閱試驗記錄。完整的試驗記錄應明確包含下列幾類(lèi)信息：

（1）樣品記錄，至少應包括：取樣日期、樣品名稱(chēng)、樣品規格、樣品批號、取樣地點(diǎn)、取樣方式、取樣人、原始試驗記錄序號。

（2）滅菌物品制備記錄，至少應包括：

①培養基：培養基名稱(chēng)、培養基批號、各組分的稱(chēng)取量（g）、純化水用量（mL）、培養基分裝數量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和時(shí)間、滅菌后pH值（冷卻至25℃測定，不得超過(guò)規定值的±0.2）、制備人、培養基存放地點(diǎn)和有效期等。

②器具：器具名稱(chēng)、器具數量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和時(shí)間、制備人、器具存放地點(diǎn)和有效期等。

（3）原始試驗記錄，至少應包括：記錄名稱(chēng)、記錄序號、樣品名稱(chēng)、樣品規格、樣品批號、滅菌批號、樣品數量、取樣日期、檢驗日期、檢驗依據、主要試驗設備及器具、使用的培養基批號、試驗方法、試驗環(huán)境條件、試驗結果（定期觀(guān)察的結果）、試驗結論、檢測人和復核人等。

（4）廢棄物處理記錄，至少應包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數量、滅菌時(shí)間和溫度、經(jīng)辦人和處理日期等。

三、其它應注意的問(wèn)題

1．生產(chǎn)企業(yè)應確保樣品具有代表性：試驗樣品應從常規產(chǎn)品中能夠代表加工過(guò)程和條件的批次中選擇。選擇樣品是隨機的。試驗樣品的選擇和試驗前預處理方式應明確，以免對樣品造成污染，或改變樣品上所含的微生物的數量和種類(lèi)。試驗樣品也可以選擇制造過(guò)程中的不合格產(chǎn)品，但所選擇的不合格產(chǎn)品應該能夠代表這個(gè)生產(chǎn)批次的加工過(guò)程和條件。用于試驗的不合格產(chǎn)品應不會(huì )影響無(wú)菌測試的有效性。

2．生產(chǎn)企業(yè)對于供試品的選取、轉移過(guò)程要采取防止污染措施，確保試驗結果的可靠性。選取制作供試品的試驗樣品時(shí)，樣品包裝須完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗室的樣品若有兩層或兩層以上包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗室。

3．無(wú)菌檢驗中接觸供試品的試驗用具溫度不能過(guò)高，以防供試品上可能存在的微生物因溫度過(guò)高被滅活。對不同種類(lèi)和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時(shí)，應更換試驗用具（如：剪刀、鑷子）。

4．進(jìn)入無(wú)菌檢驗室的所有培養基、供試品等的外表都應采用適用的方法進(jìn)行消毒處理（如：紫外燈照射不少于30分鐘；適用時(shí)，對供試品外包裝表面用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒等），以避免將外包裝污染的微生物帶入無(wú)菌檢驗室。出具試驗結果后，所有培養物須經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘的處理。

5．由于無(wú)菌檢驗時(shí)間跨度較長(cháng)，因此記錄應能夠完整體現試驗的全過(guò)程，對于在試驗過(guò)程中出現的各種情況，均應在記錄中客觀(guān)反映。

6. 在進(jìn)行無(wú)菌檢驗時(shí)，還應考慮消除產(chǎn)生假陰性的因素。產(chǎn)生假陰性的因素以及相應的消除措施包括：培養條件不能支持微生物的生長(cháng)，應按照藥典要求進(jìn)行培養基適用性檢查；產(chǎn)品中含有某種抑菌成分會(huì )導致微生物生長(cháng)微弱、緩慢或不生長(cháng)，可采用增加沖洗量、增加培養基用量、使用中和劑或滅活劑等方式消除抑菌物質(zhì)的影響；產(chǎn)品滅菌后未進(jìn)行充分的解析（如采用環(huán)氧乙烷滅菌）導致微生物被殺死，應確定滅菌后產(chǎn)品的解析時(shí)間、儲存條件及儲存時(shí)間。

附件：1.常見(jiàn)的名詞解釋

          2.供試品數量的選擇

          3.培養基的制備

          4.培養基的適用性檢查

          5.方法適用性試驗

          6.供試品處理及接種培養基

          7.對照試驗

          8.參考依據

附件1

常見(jiàn)的名詞解釋

1．滅菌：經(jīng)確認的使產(chǎn)品無(wú)存活微生物的過(guò)程。目前國際上規定，滅菌過(guò)程必須使物品污染微生物存活概率減少到10-6及以下。

2．微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒。

3．無(wú)菌技術(shù)：是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類(lèi)微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無(wú)菌環(huán)境設施、無(wú)菌檢驗器材以及無(wú)菌操作。

4．無(wú)菌操作：是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對無(wú)菌制品或無(wú)菌器械進(jìn)行檢驗的過(guò)程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規操作方法。

5．培養條件：促進(jìn)微生物復蘇、生長(cháng)和（或）繁殖所采用的生長(cháng)培養基和培養方法的組合，培養方法可包括溫度、時(shí)間和其他規定用于培養的條件。

6．需氧微生物：需要氧氣進(jìn)行代謝的微生物。

7．厭氧微生物：不需要氧氣進(jìn)行代謝的微生物。

8．抑細菌/抑霉菌試驗：用選定的微生物來(lái)演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。

9．促生長(cháng)試驗：為了證明一種培養基能夠支持微生物繁殖而進(jìn)行的技術(shù)操作。

10．假陰性：實(shí)際陽(yáng)性的無(wú)菌檢驗結果被變成了陰性。

11．假陽(yáng)性：實(shí)際陰性的無(wú)菌檢驗結果被變成了陽(yáng)性。

12．生物指示物：對規定的滅菌過(guò)程有特定的抗力，含有活微生物的測試系統。

13．化學(xué)指示物：根據暴露于某一滅菌過(guò)程所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，顯現一個(gè)或多個(gè)預定過(guò)程變量變化的測試系統。

14．無(wú)菌保證水平（SAL）：滅菌后產(chǎn)品上存在單個(gè)活微生物的概率。

15．表面活性劑：改變溶液表面能（表面張力）的成分。

16．中和劑：有抑菌成分中和能力的化學(xué)有效成分。

17．滅活劑：對抑菌成分有滅活能力的化學(xué)有效成分。

18．潔凈區：需要對環(huán)境中塵粒及微生物數量進(jìn)行控制的房間（區域），其建筑結構、裝備及其使用應當能夠減少該區域內污染物的引入、產(chǎn)生和滯留。

附件2

供試品數量的選擇

檢驗數量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠(chǎng)產(chǎn)品按中國藥典2020版四部通則1101中表1規定，上市產(chǎn)品監督檢驗按表2規定。表1、表2中最少檢驗數量不包括陽(yáng)性對照試驗的供試品用量。執行GB/T 14233系列標準的供試品數量應滿(mǎn)足標準中對于檢驗樣品數量的要求。

檢驗量是指供試品每個(gè)最小包裝接種至每份培養基的最小量。除另有規定外，每份培養基接種的供試品量按中國藥典2020版四部通則1101中表3規定。若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部?jì)热菸镞^(guò)濾。

注：若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養基，那么表中最少檢驗數量應增加相應倍數。

注：1.若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養基，那么表中的最少檢驗數量應加倍增加相應倍數。

       2.桶裝固體原料的最少檢驗數量為4個(gè)包裝。

注：①如果醫療器械體積過(guò)大培養及用量可在2000mL以上，將其完全浸沒(méi)。

附件3

培養基的制備

培養應注意培養條件：硫乙醇酸鹽流體培養基（30～35）℃14天；胰酪大豆胨液體培養基（20～25）℃14天。選擇培養條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物污染來(lái)源、可能遇到的微生物種類(lèi)。硫乙醇酸鹽流體培養基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、滅菌。

1．硫乙醇酸鹽流體培養基

胰酪胨 15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖/無(wú)水葡萄糖 5.5g/5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸 0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 mL、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸 0.3mL）、瓊脂 0.75g、水 1000 mL

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH，使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過(guò)培養基深度的1/3 ，否則，須經(jīng) 100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò) 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。

除另有規定外，硫乙醇酸鹽流體培養基置 （30～35）℃培養。

2．胰酪大豆胨液體培養基

胰酪胨 17.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g、磷酸氫二鉀 2.5g、葡萄糖/無(wú)水葡萄糖 2.5g/2.3g、水 1000 mL

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過(guò)，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。

胰酪大豆胨液體培養基置（20～25）℃培養。

3．中和或滅活用培養基

按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨液體培養基的處方及制法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗。

4．0.5%葡萄糖肉湯培養基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無(wú)菌檢驗）

胨 10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、葡萄糖 5.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為 7.2±0.2，分裝，滅菌。

5．胰酪大豆胨瓊脂培養基

胰酪胨 15.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g、瓊脂 15.0g、水1000 mL。

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。

6．沙氏葡萄糖液體培養基

動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

7．沙氏葡萄糖瓊脂培養基

動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖 40.0g、水 1000 mL。

除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

8．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）

馬鈴薯(去皮) 200g、瓊脂 14.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL。

取馬鈴薯，切成小塊，加水1000 mL，煮沸20～30分鐘，用6～8層紗布過(guò)濾，取濾液補水至1000 mL，調節pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

附件4

培養基的適用性檢查

1．無(wú)菌性檢查

每批培養基一般隨機取不少于5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無(wú)菌生長(cháng)。

2．靈敏度檢查

菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。

所用菌株包括：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]。

3．菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基中或胰酪大豆胨瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，（30～35）℃培養18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，（20～25）℃培養2～3天，上述培養物用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。

接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，（20～25）℃培養5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

菌懸液若在室溫下放置，一般應在2小時(shí)內使用，若保存在（2～8）℃可在24小時(shí)內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗證過(guò)的貯存期內使用。

4．培養基接種

取適宜裝量的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的胰酪大豆胨液體培養基7支，分別接種不大于100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細菌的培養管培養時(shí)間不超過(guò)3天，接種真菌的培養管培養時(shí)間不得超過(guò)5天。

5．結果判定

空白對照管應無(wú)菌生長(cháng)，若加菌的培養基管均生長(cháng)良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。

附件5

方法適用性試驗

1．菌種及菌液制備

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

2．薄膜過(guò)濾法

按供試品的無(wú)菌檢驗要求，取每種培養基規定接種的供試品總量，采用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗菌，過(guò)濾。加培養基至濾筒內，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內加硫乙醇酸鹽流體培養基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內加胰酪大豆胨液體培養基。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規定溫度培養，培養時(shí)間不得超過(guò)5天。

3．直接接種法

取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養基用量要求的胰酪大豆胨液體培養基6管，分別接入不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供試品的無(wú)菌檢驗要求，接入每支培養基規定的供試品接種量，另1管作為對照，置規定的溫度培養，培養時(shí)間不得超過(guò)5天。

4．結果判斷

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長(cháng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢驗。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長(cháng)微弱、緩慢或不生長(cháng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗。

方法適用性試驗也可與供試品的無(wú)菌檢驗同時(shí)進(jìn)行。

附件6

供試品處理及接種培養基

直接接種法：即取規定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基中。除另有規定外，每個(gè)容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積（采用洗脫法時(shí)，應為洗脫液體積）不得大于培養基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15mL，胰酪大豆胨液體培養基每管裝量不少于10mL。

薄膜過(guò)濾法：將供試液混勻，過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過(guò)濾器，分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基加入相應的濾筒內。

薄膜過(guò)濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過(guò)濾器，無(wú)菌檢驗用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時(shí)，應保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。

附件7

對照試驗

1．陽(yáng)性對照：陽(yáng)性對照應根據供試品特性選擇陽(yáng)性對照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽(yáng)性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量不大于100cfu，供試品用量同供試品無(wú)菌檢驗每份培養基接種的樣品量。陽(yáng)性對照管培養不超過(guò)5天應生長(cháng)良好。

2．陰性對照：供試品無(wú)菌檢驗時(shí)，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長(cháng)。

3．稀釋液、沖洗液及其制備方法

稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

（1）0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時(shí)濾過(guò)使澄清，調節pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

（2）pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g，無(wú)水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時(shí)濾過(guò)使澄清，分裝，滅菌。

（3）根據供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗證過(guò)的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。（如0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液）

如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

附件8

參考依據

1.《中華人民共和國藥典》（2020年版）

2.《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法》系列標準（GB/T 14233）

3.《醫藥工業(yè)潔凈室（區）懸浮粒子的測試方法》（GB/T 16292-2010）

4.《醫藥工業(yè)潔凈室（區）浮游菌的測試方法》（GB/T 16293-2010）

5.《醫藥工業(yè)潔凈室（區）沉降菌的測試方法》（GB/T 16294-2010）

6.《實(shí)驗室 生物安全通用要求》（GB 19489-2008）

7.《醫療保健產(chǎn)品滅菌 術(shù)語(yǔ)》（GB/T 19971-2015）

8.《醫療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第2部分：用于滅菌過(guò)程的定義、確認和維護的無(wú)菌試驗》（GB/T 19973.2-2018）

9.《生物安全實(shí)驗室建筑技術(shù)規范》（GB 50346-2011）

10.《醫療器械安全通用要求檢驗操作規范》，中國醫藥科技出版社（2019年）