乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（2013年第3號）

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乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則
（2013年第3號）

一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid, DNA）定量檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）定量檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究?jì)热?，可自行補充。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

二、適用范圍

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個(gè)嚴重的公共衛生問(wèn)題，我國屬乙型肝炎感染地方性流行區。根據2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調查，我國的慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例，每年因乙型肝炎導致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬(wàn)例，新發(fā)乙型肝炎病例約50萬(wàn)～100萬(wàn)例，乙肝防治是當前及今后相當長(cháng)時(shí)間內要面臨的重要任務(wù)。

乙型肝炎是血源傳播性疾病，主要經(jīng)血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。HBV屬嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長(cháng)約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。急性HBV感染DNA存在先陽(yáng)性后消失的發(fā)展過(guò)程，慢性HBV感染的自然史一般可分為4個(gè)期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低（非）復制期和再活動(dòng)期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度較高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表現為血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活動(dòng)或低（非）復制期滴度較低（小于2000 IU/ml），部分再活動(dòng)期患者表現為HBV DNA活動(dòng)性復制，但并不是所有HBV感染者都經(jīng)歷以上四期。

HBV已發(fā)現有9個(gè)基因型（A～I），每個(gè)基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現象。我國已發(fā)現A、B、C、D基因型，中東部地區以B、C基因型占優(yōu)勢，其中北方地區（長(cháng)江以北）主要為C2亞型;南方大部分地區流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型;西部地區尤其是新疆地區以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主;A型和B1亞型罕見(jiàn)。

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學(xué)方法在內的核酸檢測技術(shù)，以HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進(jìn)行體外定量檢測的試劑。結合臨床表現和其他實(shí)驗室指標，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標之一，還可通過(guò)對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導原則適用于實(shí)時(shí)熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑，其他類(lèi)同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導原則，但應根據產(chǎn)品特性確定其中具體內容是否適用，如不適用，應另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價(jià)方法。本指導原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

本指導原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結果的總結評價(jià)以及同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內容，其中同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應著(zhù)重從方法學(xué)及檢出限等方面寫(xiě)明擬申報產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區別。應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實(shí)驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學(xué)解釋的重要依據。因此，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，境外產(chǎn)品的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進(jìn)行標注，并單獨列明參考文獻的相關(guān)信息。

結合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，下面對HBV DNA定量檢測試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內容進(jìn)行詳細說(shuō)明，以指導注冊申報人員更合理地制定產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

（1）試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類(lèi)型應依據申報產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進(jìn)行確認。

（2）待測人群特征介紹：主要為接受抗病毒治療的乙型肝炎患者。

（3）臨床用途：主要通過(guò)對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線(xiàn)水平和變化情況的監測，用于評估抗病毒治療的應答和治療效果監測。

如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應對產(chǎn)品適應癥人群、預期用途另行說(shuō)明，并提供與之相應的分析性能評估以及臨床驗證等資料。本指導原則內容僅針對治療監測用途進(jìn)行要求。

（4）應當說(shuō)明該試劑檢測結果不得作為患者病情評價(jià)的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實(shí)驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

（5）明確說(shuō)明該檢測試劑不得用于血源篩查。

2.【主要組成成分】

（1）說(shuō)明試劑盒所包含組分的名稱(chēng)、數量、比例或濃度等信息，如定量標準品、陰/陽(yáng)性質(zhì)控品含有人源組分，應提供其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他特性;說(shuō)明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

（2） 試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說(shuō)明書(shū)中應列出相關(guān)試劑/耗材的名稱(chēng)、注冊證號（如有）及其他相關(guān)信息。

（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)、注冊證號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩定性、開(kāi)封穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

（1）樣本收集要求：結合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現行版）推薦的采樣要求。

（2）血液樣本應當說(shuō)明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類(lèi)型、采血管和抗凝劑，其他樣本應說(shuō)明樣本采集、處理及保存方式。

（3）樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長(cháng)期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復至室溫，凍融次數的要求。如有需要應對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規定。

5.【適用機型】注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導用戶(hù)操作。

6.【檢驗方法】詳細說(shuō)明試驗操作的各個(gè)步驟，包括：

（1）試劑準備及配制方法、注意事項。

（2）詳述待測樣本、相關(guān)校準品及質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

（3）核酸提取/純化方法的詳細介紹。

（4）擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

（5）PCR各階段的溫度、時(shí)間設置、循環(huán)設置及相關(guān)注意事項。

（6）儀器設置：特殊參數、結合探針的熒光素標記情況對待測基因及內標的熒光通道選擇。

（7）基線(xiàn)、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

（8）校準方法的描述。

（9）實(shí)驗的有效性判斷：試劑盒內陰/陽(yáng)性質(zhì)控品、內標的Ct值要求。

7.【檢驗結果的解釋】

檢驗結果應用IU/ml表示，結合陰、陽(yáng)性質(zhì)控結果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內及高于檢測范圍的檢測結果分別進(jìn)行界定。

8.【檢驗方法的局限性】

（1）本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

（2）不合理的樣本采集、轉運、儲存及處理過(guò)程均有可能導致錯誤的檢測結果。

（3）明確該試劑僅限于規定的樣本類(lèi)型及適用機型。

9.【產(chǎn)品性能指標】詳述以下性能指標：

（1）對相應國家參考品的符合情況。

（2）最低檢出限及定量限：說(shuō)明試劑不同樣本類(lèi)型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡(jiǎn)單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗證所采用的基因型。

（3）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價(jià)標準、評價(jià)結果。

（4）線(xiàn)性范圍：確定線(xiàn)性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數等信息。

（5）對不同基因型的覆蓋：驗證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

（6）特異性：

①臨床特異性：應采用一定數量的臨床HBV DNA陰性樣本進(jìn)行驗證。

②交叉反應：易產(chǎn)生交叉反應的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過(guò)交叉反應驗證的病原體名稱(chēng)、型別、濃度等信息。

③干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對檢測結果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應注明可接受的最高限值。

④藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應提供相關(guān)警示說(shuō)明。

（7）對比試驗研究：簡(jiǎn)要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學(xué)方法及統計分析結果。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

（1）有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內校準品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過(guò)乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒(méi)有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）臨床實(shí)驗室應嚴格按照《臨床基因擴增實(shí)驗室工作規范》配備設備及操作人員，應嚴格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說(shuō)明

擬定產(chǎn)品標準應符合國食藥監械〔2007〕229號和國食藥監械〔2007〕609號文件的相關(guān)規定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應參考《中國生物制品規程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類(lèi)”項中引出該附錄內容。附錄中應將待測靶基因區域，引物/探針來(lái)源及驗證情況，各種酶的來(lái)源、特性以驗證情況等信息的重點(diǎn)內容予以明確。

HBV DNA定量檢測試劑的注冊檢測應符合相應國家參考品檢測要求。產(chǎn)品的性能指標應與說(shuō)明書(shū)內容相符。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據國食藥監械〔2007〕229號要求，首次申請注冊的第三類(lèi)產(chǎn)品應在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進(jìn)行連續三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家參考品的HBV DNA項目，在注冊檢測時(shí)應采用相應的國家參考品進(jìn)行。

（五）主要原材料研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、酶、標準品或企業(yè)參考品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標準等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須穩定;如主要原材料源于外購，應提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠(chǎng)檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.企業(yè)內部參考品的制備、定值過(guò)程。建議采用滅活病毒的血清/血漿建立參考品，不宜使用質(zhì)粒。

2.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

3.聚合酶鏈反應（PCR）組分的主要材料（包括引物、探針、內標、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標準及實(shí)驗研究資料，主要包括以下內容：

（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩定性等的詳細驗證資料。

（2）引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對序列準確性、純度、穩定性、功能性實(shí)驗等的驗證。如為外購，應提供合成機構出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3） 探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAEG或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進(jìn)行標記，如熒光素報告基團或其他發(fā)光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化,純度應達到高效液相色譜純。如為外購，應提供合成機構出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜;應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。

（4） PCR反應所需酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內切酶活性，具熱穩定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性;尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內切酶活性，應對酶活性有合理驗證;應提供有關(guān)保存穩定性、活性及功能實(shí)驗等的驗證資料。

4.內對照（內標）、校準品及質(zhì)控品的原料選擇、制備、定值過(guò)程及試驗資料。內標設置應合理，質(zhì)控品宜采用混合陰性人血漿或血清作為基質(zhì)。

5.核酸類(lèi)檢測試劑的包裝材料和耗材應無(wú)脫氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過(guò)程應對pH、電導率等關(guān)鍵參數進(jìn)行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類(lèi)型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質(zhì)控方法、穩定性和有效期，提供確切的依據，主要包括以下內容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。

3.基因位點(diǎn)選擇、PCR方法學(xué)特性介紹。

4. DNA提取純化方法優(yōu)化，建議包含純化步驟，內標、校準品、質(zhì)控品均應全程參與提取純化，不建議采用煮沸法進(jìn)行DNA提取。

5.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度、樣本量、加樣量及反應體積等。樣本量應不少于200微升，加樣量和反應體積參考相應行業(yè)標準，經(jīng)研究驗證后確定。

6.確定PCR各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數的研究資料。

7.對于基線(xiàn)閾值（threshold）和閾值循環(huán)數（Ct）確定的研究資料。

8.不同適用機型的反應條件的對比分析，如果有差異應分別詳述。

另外，對于試劑盒的內標、校準品、質(zhì)控品設置，建議企業(yè)參考以下要求執行：

（1）樣本反應管應設置合理的內對照（內標）以對管內抑制可能造成的假陰性結果進(jìn)行質(zhì)控。申請人應對內標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導致假陰性，對內標的Ct應有明確的范圍要求。

（2）HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)控品應至少設置三個(gè)量級水平的系列質(zhì)控品:臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。校準品和質(zhì)控品均應參與樣本核酸的平行提取，以對整個(gè)PCR反應過(guò)程、試劑/設備、交叉污染等環(huán)節進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應對各種質(zhì)控品的Ct做出明確的范圍要求。

（七）分析性能評估資料

申請人應提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價(jià)都應包括具體研究目的、實(shí)驗設計、研究方法、可接受標準、實(shí)驗數據、統計方法等詳細資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實(shí)驗地點(diǎn)（實(shí)驗室）、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來(lái)源等。分析性能評價(jià)的實(shí)驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗室標準化協(xié)會(huì )批準指南（CLSI-EP）文件或國內有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則進(jìn)行。對于HBV DNA定量檢測試劑，建議著(zhù)重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1. HBV DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節。因此，無(wú)論申報產(chǎn)品是否含有DNA分離/純化的組分，企業(yè)都應對核酸提取的環(huán)節做詳細的驗證。臨床標本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見(jiàn)的DNA分離純化方法和改良方法各有優(yōu)勢和不足，申請人應結合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料（提取效率、與后續試驗的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽(yáng)性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。建議最低檢出限應不高于30IU/ml。

定量限應高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結果符合試劑準確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗證，總測試數不少于60次。定量限的驗證應對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗證，總測試數不少于40次。

企業(yè)應能夠提供用于最低檢出限/定量限驗證的各個(gè)病毒株的來(lái)源、型別確認及滴度確認試驗等信息。

3.線(xiàn)性范圍

線(xiàn)性范圍確定的研究應使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂屢簯褂媒?jīng)確認為陰性的混合人血清或血漿，應包含不少于9個(gè)濃度（應包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個(gè)批次的試劑進(jìn)行試驗。通過(guò)評價(jià)一定范圍內的線(xiàn)性關(guān)系及各水平的準確度確定該產(chǎn)品的線(xiàn)性范圍。

4.準確度

對測量準確度的評價(jià)依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收實(shí)驗、方法學(xué)比對等方法，企業(yè)可根據實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

（1）國家/國際參考品驗證

此類(lèi)檢測試劑有相應的國家/國際參考品，應使用國家/國際參考品對試劑進(jìn)行驗證，重點(diǎn)觀(guān)察對相應參考品檢測結果的符合情況。

（2）回收試驗。用于評估定量檢測方法準確測定加入純分析物的能力，結果用回收率表示。通常對樣本進(jìn)行3～5次回收試驗，取平均值即平均回收率。

回收試驗注意事項：

①加入的標準液體積一般應小于樣本體積的10%;

②盡量使加入標準液后樣本中的被測物濃度接近醫學(xué)決定水平;

③標準物的濃度應該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本;

④注意基質(zhì)效應，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質(zhì)

（3）方法學(xué)比對

采用參考方法或國內/國際普遍認為質(zhì)量較好的同類(lèi)試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時(shí)檢測一批病人樣品，從測定結果間的相關(guān)性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著(zhù)相關(guān)，說(shuō)明兩檢測系統對病人標本測定結果基本相符，對同一份臨床樣本的醫學(xué)解釋?zhuān)瑪M申報試劑與對比方法相比不會(huì )產(chǎn)生顯著(zhù)差異結果。

在實(shí)施方法學(xué)比對前，應分別對擬申報試劑和對比試劑進(jìn)行初步評估，只有在確認兩者都分別符合各自相關(guān)的質(zhì)量標準后方可進(jìn)行比對試驗。方法學(xué)比對時(shí)應注意質(zhì)量控制、樣本類(lèi)型、濃度分布范圍并對結果進(jìn)行合理的統計學(xué)分析。

5.精密度

測量精密度的評價(jià)方法并無(wú)統一的標準可依，可根據不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實(shí)驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實(shí)驗室標準化協(xié)會(huì )批準指南（CLSI-EP）或國內有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。企業(yè)應對每項精密度指標的評價(jià)標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類(lèi)產(chǎn)品的精密度評價(jià)主要包括以下要求：

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除申報試劑（包括提取組分和聚合酶鏈反應組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

（2）合理的精密度評價(jià)周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價(jià)。如有條件，申請人應選擇不同的實(shí)驗室進(jìn)行重復實(shí)驗以對室間精密度進(jìn)行評價(jià)。

（3）用于精密度評價(jià)的質(zhì)控品應至少包括四個(gè)水平:

①陰性質(zhì)控品：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的質(zhì)控品，不得檢出陽(yáng)性（n≥20）。

②臨界陽(yáng)性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽(yáng)性檢出率應高于95%（n≥20）。

③弱陽(yáng)性質(zhì)控品：待測物濃度呈弱陽(yáng)性（高于定量限濃度1個(gè)數量級），陽(yáng)性檢出率為100%且變異系數（CV）符合標準要求（n≥20）。

④強陽(yáng)性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度至強陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且CV符合標準要求（n≥20）。

6.HBV不同基因型的覆蓋

應對乙肝病毒不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行檢測，重點(diǎn)考察各基因型病毒樣本的分析靈敏度、準確性及精密度指標，每個(gè)基因型的病毒樣本稀釋成至少3個(gè)濃度水平，對每水平樣本進(jìn)行重復測定。

7.特異性

（1）交叉反應

①用于HBV DNA檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類(lèi)主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類(lèi)見(jiàn)表1）。

②建議在病毒和細菌感染的醫學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶cfu/ml或更高，病毒為10⁵pfu/ml或更高。

③申請人應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來(lái)源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關(guān)交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現。

表1 用于交叉反應研究的微生物（推薦）

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內源性物質(zhì)（見(jiàn)表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

②使用醫學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進(jìn)行評價(jià)。對于常見(jiàn)藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進(jìn)行干擾驗證。

③建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。

表2 建議用于干擾研究的物質(zhì)（推薦）

*為必須驗證的干擾物質(zhì)。

8.溯源性

應提交詳細的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準品的儲備液以及不同基因型的陽(yáng)性樣本均應能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準品，應用多臺儀器對企業(yè)一級參考品進(jìn)行校準，以下逐級對企業(yè)二級參考品、校準儲備液、陽(yáng)性參考品進(jìn)行校準。

9.其他需注意問(wèn)題

對于適用多個(gè)機型的產(chǎn)品，應提供如產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類(lèi)型，應提交對不同樣本類(lèi)型一致性的驗證，包括不同抗凝劑、采血管的驗證。

（八）參考值（范圍）確定資料

對于此類(lèi)試劑，正常人群中不應檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)的方式對申報產(chǎn)品用于結果判斷的臨界值予以確認。

（九）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩定性（有效期）、運輸穩定性、開(kāi)瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實(shí)際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實(shí)施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實(shí)時(shí)穩定性研究，應提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應對樣本穩定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段即對儲存樣本進(jìn)行全性能的分析驗證，從而確認不同類(lèi)型樣本的效期穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進(jìn)行評價(jià)。

試劑穩定性和樣本穩定性?xún)刹糠謨热莸难芯拷Y果均應在說(shuō)明書(shū)【儲存條件及有效期】和【樣本要求】?jì)身椫羞M(jìn)行詳細說(shuō)明。

（十）臨床試驗研究

1.研究方法

對于該類(lèi)試劑已有同類(lèi)產(chǎn)品上市，按照法規要求選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為對比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱(chēng)考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

建議預實(shí)驗選擇兩種對比試劑同時(shí)進(jìn)行驗證，考察其誤差范圍，選擇其中一種作為正式試驗的對比試劑，另一種可作為第三方試劑。對比試劑的適用樣本類(lèi)型及檢測范圍應能夠涵蓋考核試劑的樣本及檢測性能要求，以免造成考核試劑部分性能無(wú)法驗證的情況。

對比試驗結果不一致（檢測值差異較大）的樣本應采用公認較好的第三方試劑進(jìn)行驗證。

2.臨床研究單位的選擇

建議申請人在選擇臨床研究單位時(shí)，應考慮到各試驗單位之間的平行性和一定的地域代表性，臨床研究單位應具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗中，考核試劑和對比試劑都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實(shí)施前，研究人員應從流行病學(xué)、統計學(xué)、臨床醫學(xué)、檢驗醫學(xué)等多方面考慮，設計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗過(guò)程中遵循預定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗過(guò)程應在臨床研究機構的實(shí)驗室內并由本實(shí)驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實(shí)驗進(jìn)程，尤其是數據收集過(guò)程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗操作過(guò)程中和判定試驗結果時(shí)應采用盲法以保證試驗結果的客觀(guān)性。各研究單位選用的對比試劑應一致，以便進(jìn)行合理的統計學(xué)分析，同時(shí)方案中應明確寫(xiě)明對于對比試驗研究中測定結果不符的樣本進(jìn)行確認試驗的第三方試劑或方法。

4.病例選擇及樣本類(lèi)型

臨床試驗應樣本數需不少于500例，其中應主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽(yáng)性樣本），不少于450例。在病例選擇時(shí)應考慮到地域性的差別，應涵蓋不少于10例D基因型，應注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽(yáng)性樣本應覆蓋試劑線(xiàn)性范圍，均勻分布高、中、低值。建議選擇不少于50例的陰性樣本進(jìn)行比對試驗，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應情況，應選擇其他類(lèi)肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類(lèi)型應為實(shí)際臨床檢測中常用的樣本類(lèi)型。對于同時(shí)能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，應對至少50例同一乙型肝炎患者分別采集的血清和血漿樣本進(jìn)行比對試驗研究，陽(yáng)性樣本應包括強、中、弱陽(yáng)性及部分陰性樣本。

臨床研究應以新鮮樣本為主，如采用庫存樣本應另行說(shuō)明 。

5.統計學(xué)分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，對于本類(lèi)產(chǎn)品對比實(shí)驗的等效性研究，常用相關(guān)性、線(xiàn)性回歸對log10滴度結果進(jìn)行統計分析，考察兩組數據之間是否存在相關(guān)性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無(wú)明顯統計學(xué)差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價(jià)考核試劑與對比試劑是否等效的標準。選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗，對檢驗結果進(jìn)行符合率分析，計算陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率。

6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過(guò)程中，對于兩種試劑的檢測結果有不一致（檢測結果差異較大）的樣本，應采用臨床上公認較好的第三種同類(lèi)試劑進(jìn)行確認試驗，同時(shí)結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗總結報告撰寫(xiě)

根據《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應該對整個(gè)臨床試驗實(shí)施過(guò)程、結果分析、結論等進(jìn)行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進(jìn)行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準。

③樣本類(lèi)型，樣本的收集、處理及保存等。

④統計學(xué)方法、統計軟件、評價(jià)統計結果的標準。

（2） 具體的臨床試驗情況

①申報試劑和對比試劑的名稱(chēng)、批號、有效期及所用機型等信息。

②對各研究單位的病例數、年齡分布情況、不同基因型分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結果評估。

④具體試驗過(guò)程，樣本檢測、數據收集、樣本長(cháng)期保存、結果不一致樣本的校驗等。

（3） 統計學(xué)分析

①數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對方案的修改。

②兩組數據結果的相關(guān)性、線(xiàn)性回歸的結果。

③對相關(guān)性及線(xiàn)性方程的顯著(zhù)性檢驗，驗證兩種試劑定量結果的一致性。

④陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區間。

⑤以交叉表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗。

另外考慮到對不同樣本類(lèi)型的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類(lèi)型分別進(jìn)行統計分析，以對考核試劑的臨床性能進(jìn)行綜合分析。

（4） 討論和結論

對總體結果進(jìn)行總結性描述并簡(jiǎn)要分析試驗結果，對本次臨床研究有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗結論。

四、名詞解釋

精密度（precision）：在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學(xué)方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

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