流式細胞儀配套用檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（2013年第3號）

附件：流式細胞儀配套用檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則（2013年第3號）.doc

流式細胞儀配套用檢測試劑注冊技術(shù)審查指導原則
（2013年第3號）

一、前言

本指導原則旨在為注冊申請人準備及撰寫(xiě)流式細胞儀配套用檢測試劑注冊申報資料提供指導，同時(shí)也為技術(shù)審評部門(mén)對注冊申報資料進(jìn)行技術(shù)審評提供參考。

本指導原則是對流式細胞儀配套用檢測試劑的一般要求，申請人應依據產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學(xué)依據，并依據產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進(jìn)行充實(shí)和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應在遵循相關(guān)法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著(zhù)法規和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導原則相關(guān)內容也將適時(shí)進(jìn)行調整。

二、適用范圍

流式細胞分析是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析的檢測手段，可以在短時(shí)內高速分析大量細胞或生物粒子的物理和化學(xué)特征參數。流式細胞分析主要靠流式細胞儀和各種特定發(fā)光物質(zhì)標記的單克隆抗體試劑組合檢測來(lái)實(shí)現。流式細胞儀是集電子技術(shù)、計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論等技術(shù)原理于一體進(jìn)行流式細胞分析的儀器，其工作原理為：將待測細胞或微粒進(jìn)行特異性染色標記后制成單細胞或微粒的懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動(dòng)室，用不含細胞或微粒的緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管?chē)姵?，包繞著(zhù)細胞或微粒高速流動(dòng)形成圓形流束（鞘流），依次通過(guò)流式細胞儀的檢測區域。被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向散射光和側向散射光檢測器把散射光信號轉換成電信號，熒光則被聚光器收集，不同顏色熒光被雙色反光鏡轉向不同的光電倍增管檢測器，把熒光信號轉換成電信號。散射光信號和熒光信號經(jīng)過(guò)放大后，再經(jīng)過(guò)數據化處理輸入電腦并儲存，根據散射光和熒光信號對細胞或微粒進(jìn)行分類(lèi)或計數。其中，前向散射光反映了細胞體積的大小，側向散射光則反應細胞部分結構的信息;熒光信號強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其細胞內、核內物質(zhì)的濃度。臨床流式細胞分析是將流式細胞分析技術(shù)與方法應用于臨床醫學(xué)，與臨床疾病的診斷、分型、治療、預后及預防等相結合的綜合應用學(xué)科。其應用范圍廣泛，包括細胞生物學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、感染性疾病、造血干細胞移植、器官移植等多個(gè)方面。臨床流式細胞分析要求實(shí)驗人員對整個(gè)分析系統、各種相關(guān)實(shí)驗技術(shù)和方法有深入理解和掌握，并能對檢測結果給予合理的醫學(xué)解釋。

本指導原則中“流式細胞儀配套用檢測試劑”是指標記有熒光類(lèi)物質(zhì)（如熒光素、量子點(diǎn)等）、針對各類(lèi)血細胞或組織細胞分化抗原的單克隆抗體試劑以及相關(guān)的質(zhì)控品和校準品，這些抗體與血細胞或組織細胞的各類(lèi)抗原分子特異性結合，與相應流式細胞儀配套使用，對人血液、骨髓液、其他體液或組織標本中的被標記細胞或分子進(jìn)行分類(lèi)和計數。由于多方面差異，本文內容將不包括預期用途為利用流式細胞術(shù)進(jìn)行特異性目的細胞分選的檢測試劑。

本指導原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、方法學(xué)特征、生物安全性評價(jià)、研究結果總結以及同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內容，應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料形式與基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預期用途、實(shí)驗操作方法、檢測結果解釋以及相關(guān)注意事項等重要信息，是指導實(shí)驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學(xué)解釋的重要依據，也是體外診斷試劑注冊申報的重要文件之一。流式細胞儀檢測專(zhuān)業(yè)性較強，對產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的編制進(jìn)行必要的指導顯得更為重要。該類(lèi)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)除對單克隆抗體試劑做必要的介紹外，還應對樣本采集、樣本處理及保存、儀器校準、檢測質(zhì)量控制、結果分析等相關(guān)步驟作詳細描述，以保證分析結果的準確性和可重復性。

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，境外試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性及完整性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進(jìn)行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。結合相關(guān)法規要求及流式細胞分析的特性，下面對流式細胞儀配套用檢測試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內容作詳細說(shuō)明，以指導注冊申報人員更合理地完成說(shuō)明書(shū)編制。

1.【產(chǎn)品名稱(chēng)】

單色試劑通用名稱(chēng)建議采取以下命名方式：被檢標志物名稱(chēng)+檢測試劑盒（流式細胞儀法-熒光素）。多色試劑的命名可以結合靶抗原、目標細胞或組織、熒光素及臨床預期用途等信息綜合進(jìn)行判斷。

2.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

（1）適用的樣本類(lèi)型：如血液、骨髓液、其他體液或組織細胞等，并明確對所需抗凝劑的要求。

（2）待測靶抗原的特征簡(jiǎn)介，如分子結構、分子量、產(chǎn)生和代謝主要途徑、表達細胞等。

（3）與被檢標志物相關(guān)的臨床背景介紹、正常表達情況、異常表達的主要疾病等。

（4）強調：實(shí)驗操作人員應接受過(guò)流式細胞儀檢測的專(zhuān)業(yè)培訓，具備相關(guān)的實(shí)驗操作資格，實(shí)驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。

3.【主要組成成分】

（1）主要是對特定熒光素標記的單克隆抗體特征的描述，應包括抗體特異性，雜交瘤細胞，免疫球蛋白特征，熒光激發(fā)及發(fā)射波長(cháng)，偶聯(lián)的熒光素，抗體濃度以及其他非抗體成分組成及濃度。

（2）如包括多種不同熒光素標記的單克隆抗體，則應對不同的抗體分別列表詳述上述特征。

（3）建議將實(shí)驗需要但本試劑盒未提供的主要材料進(jìn)行列舉：如與之配套使用的紅細胞溶解試劑、稀釋劑、細胞/血球計數儀等。

4.【儲存條件及有效期】

包括試劑盒的效期穩定性、開(kāi)封穩定性、運輸穩定性等有關(guān)試劑保存的重要信息;如有必要,應注明試劑表面變化或變質(zhì)時(shí)情況的描述及相關(guān)警示。

5.【樣本要求】

樣本采集和處理的目標是獲得均勻的單細胞或其他生物微粒的懸液，同時(shí)必須盡量保證其活力和完整性。樣本操作不宜過(guò)度，避免對其結構和抗原性造成破壞。故對于流式細胞分析而言，樣本處理對實(shí)驗結果至關(guān)重要，應盡量減少由于樣本采集或處理不當對實(shí)驗造成的影響。

在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中應重點(diǎn)對以下內容予以明確：

（1）所需的樣本量、采樣方法（對抗凝劑或抗凝管的要求）及樣本采集的注意事項，盡量引述相關(guān)標準操作規程。

（2）樣本處理：溶血洗滌（或非洗滌）、細胞分離和提純描述、離心和固定等方法;樣本保存、轉運的條件和方法。

（3）染色前穩定性：即采樣后在合理的保存條件下，多長(cháng)時(shí)間內必須進(jìn)行抗體標記（染色）;如果不同抗凝劑樣本的穩定時(shí)間有差異，則應分別進(jìn)行闡述。

（4）染色后穩定性：即樣本在完成抗體標記后至上機分析前可以穩定保存的條件及期限，最好結合染色前穩定性的要求對上機分析前的穩定性進(jìn)行綜合闡述。

（5）避免使用的樣本類(lèi)型，如有微生物污染、乳糜、凝集或細胞活力不達標準等，在一般情況下應避免使用上述樣本，除非樣本有不可替代性，則應說(shuō)明處理該種樣本的方法，并應在結果報告時(shí)明示。

（6）達到最佳染色效果所要求的目標細胞濃度、計數方法及相關(guān)注意事項。

（7）樣本處理過(guò)程可能對細胞活性造成一定影響而導致活性細胞的比例降低，如果細胞活性對實(shí)驗結果的解釋非常重要，生產(chǎn)商需提供細胞活性的評估方法，避免非活性細胞的非特異性結合從而影響檢測結果。

（8）優(yōu)化為最佳染色效果所需注意的重要信息;其他有關(guān)樣本采集、處理及保存的注意事項。

6.【適用機型】所有適用的儀器型號，如對配套用軟件有要求也應做說(shuō)明，并提供與儀器或軟件有關(guān)的重要信息以指導用戶(hù)操作。

7.【檢驗方法】對于流式細胞分析而言，實(shí)驗操作步驟對實(shí)驗結果的影響至關(guān)重要，因此，應詳細說(shuō)明達到最佳染色效果的實(shí)驗操作各個(gè)步驟，包括：

（1）試劑使用條件：溫度/濕度條件（如有必要）、試劑用量、染色時(shí)間、是否需無(wú)菌操作等。

（2）簡(jiǎn)述試驗開(kāi)始前流式細胞儀的設置方法，校準及質(zhì)控程序。

（3）詳細闡述試驗操作步驟、注意事項。如對照的設定方式及類(lèi)別（同型陰性對照、陽(yáng)性對照、正常人血細胞對照等），設門(mén)方法舉例及代表性數據圖示;靶細胞分類(lèi)計數的方法及步驟、計算公式以及相關(guān)注意事項。

（4）校準：適用校準品的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)及貨號等詳細信息，校準品的使用方法、推薦的校準周期及相關(guān)注意事項。

（5）質(zhì)量控制：適用質(zhì)控品的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)及貨號等詳細信息，如果質(zhì)控品和病人樣本的使用方法不同，生產(chǎn)商應注明必要的指導和解釋。建議在質(zhì)量控制環(huán)節注明以下字樣：“如果質(zhì)控結果與預期不符，實(shí)驗室應重復試驗以保證結果的可靠性。如不能獲得可靠性結果，則不應出具檢測報告?！睂?shí)驗室應負責質(zhì)量控制失敗的解決方案。

8.【參考值（參考范圍）】

應注明待測標記細胞或分子在常用樣本類(lèi)型的正常參考值（范圍），簡(jiǎn)單介紹設定該參考值（范圍）所選健康人群的特征，如有必要，需對不同年齡段人群、不同性別或具有明確地理差異人群的參考值分別進(jìn)行詳述。

建議注明以下字樣“由于地理、人種、性別及年齡等差異，建議各實(shí)驗室建立自己的參考值（范圍）”。

9.【檢驗結果的解釋】

由于流式細胞儀分析技術(shù)的專(zhuān)業(yè)性較強，檢測過(guò)程中的影響因素較多且同一分析目標在不同人群的表達復雜多樣，因此，流式細胞檢測的數據分析、結果解釋和出具臨床報告經(jīng)常具有較大的挑戰性，結果解釋不當可能對病人的診治造成很大影響。建議負責數據解釋和出具報告的實(shí)驗人員需經(jīng)過(guò)正規的技術(shù)培訓且有一定的臨床經(jīng)驗，二者結合有助于對實(shí)驗數據作出合理的醫學(xué)解釋。

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中的本部分內容應對上述情況進(jìn)行必要的建議，還應對設門(mén)方法、數據分析、異常值處理、臨床相關(guān)提示等內容作出合理解釋。

10.【檢驗方法局限性】

（1）本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

（2）使用該試劑的其他限制，如樣本、保存方法、保存時(shí)間，特殊患者可能出現的不正確結果，儀器設置不當的影響等。

（3）是否與經(jīng)其他試劑或儀器獲得的同類(lèi)數據具直接可比性。

11.【產(chǎn)品性能指標】 詳述以下性能指標：

（1）精密度：簡(jiǎn)要說(shuō)明精密度評價(jià)的方法，建議以列表的方式列出批內/批間、日內/日間、運行內/運行間精密度等信息，以標準差（SD）和變異系數（CV）的形式表示精密度研究結果。

（2）線(xiàn)性：包括細胞計數濃度范圍和待測目標物陽(yáng)性細胞百分比濃度范圍兩類(lèi)，申請人應對適于待測標記物的至少一個(gè)指標進(jìn)行合理驗證，簡(jiǎn)要注明實(shí)驗方法、所用儀器及軟件等信息。

（3）對比試驗研究：簡(jiǎn)要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統計學(xué)方法及統計分析結果、圖示。

（4）分析特異性：有關(guān)交叉反應和干擾因素的驗證信息或風(fēng)險分析。如：對溶血、高脂、黃疸等內源性干擾因子的濃度限值要求，樣本中可能存在某些內生物質(zhì)與待測抗原有相似化學(xué)結構或抗原表位，如自身抗體、蛋白、激素或近期服用的某些藥物（如生物制劑），這些物質(zhì)可能與試劑中的單克隆抗體發(fā)生交叉反應而影響檢測結果，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應提供相關(guān)警示說(shuō)明。

12.【注意事項】應至少包括以下內容：

（1）生物安全性警告：接觸到的臨床樣本、質(zhì)控/校準品、實(shí)驗廢棄物等材料應當作為潛在傳染物進(jìn)行處理，并且采用符合法規的預防措施對其處理。

（2）有關(guān)儀器設置的警示，如：流式細胞儀未經(jīng)正確校準、熒光滲漏未行合理補償以及檢測區域（設門(mén)）未精確定位，則可能產(chǎn)生錯誤的檢測結果。

（3）有關(guān)試劑準備的注意事項：如冷藏避光保存、切勿冷凍、使用前恢復室溫等。

（4）針對某些白細胞濃度過(guò)高或過(guò)低的情況，在樣本處理時(shí)需采用的特殊處理方式，如血樣稀釋或細胞濃縮等操作。

（5）試劑特殊成分或操作使用試劑危害性的警告及注意事項：如疊氮化鈉、甲醛等;使用不當的處理方式。

（6）保證試驗結果準確的其他操作注意事項。

（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說(shuō)明

擬定產(chǎn)品標準應符合國食藥監械〔2007〕229號和國食藥監械〔2007〕609號文件的相關(guān)規定。另外，對于國產(chǎn)第三類(lèi)體外診斷試劑，應參考《中國生物制品規程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類(lèi)”項中引出該附錄內容。

該類(lèi)產(chǎn)品注冊檢測的技術(shù)要求主要包括：準確度、線(xiàn)性、精密度、染色穩定性等相關(guān)指標，具體要求的設置應參考相關(guān)的國家/行業(yè)標準（如有）執行，企業(yè)標準要求不得低于國家/行業(yè)標準要求。

（四）注冊檢測

對于首次注冊產(chǎn)品，申請人擬定申報產(chǎn)品的產(chǎn)品標準后，應當在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進(jìn)行連續3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。

對于已經(jīng)有國家參考品的流式細胞檢測項目，在注冊檢測時(shí)應采用相應的國家參考品進(jìn)行,對于目前尚無(wú)國家參考品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應建立自己的質(zhì)控體系并提供相應的內部參考品。

（五）主要原材料研究資料

應提供主要原材料如單克隆抗體、標記熒光素的選擇、來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量標準和質(zhì)檢報告等研究資料。若主要原材料為企業(yè)自行生產(chǎn)，則應詳述原材料（主要是單克隆抗體）的制備及生產(chǎn)過(guò)程、雜交瘤細胞的選擇、技術(shù)指標、質(zhì)量控制、國際相關(guān)權威機構（如國際人類(lèi)白細胞分化抗原協(xié)作組織）的認證情況（如有）等;如主要原材料來(lái)自外購，則應詳述抗體的名稱(chēng)及生物學(xué)來(lái)源，外購方名稱(chēng)，提交外購方出具的有關(guān)單克隆抗體和/或雜交瘤細胞的性能分析或檢驗證書(shū)，詳述申請人對該抗體技術(shù)指標的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據。對熒光染色方法、染料選擇依據、標記熒光穩定性，多色標記中熒光的交叉重疊驗證等研究。質(zhì)控品、校準品原料選擇、制備、定值過(guò)程及試驗資料;校準品溯源性文件等。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

1.生產(chǎn)工藝的研究資料主要包含：

（1）主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式（工藝流程圖）表示。

（2）生產(chǎn)工藝中關(guān)鍵步驟的質(zhì)量控制要求及質(zhì)控方法。

（3）生產(chǎn)商所采用的生產(chǎn)工藝和方法的驗證資料。

2.反應體系的研究資料主要包含：

（1）反應原理介紹。

（2）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中描述的所選反應條件各步驟的分析性能數據，例如需要的樣本體積，樣本的處理、保存時(shí)間，反應時(shí)間、溫度的確定，抗體的用量（重要），是否需反向加樣、溶血/洗滌操作，去除干擾等。

（3）應說(shuō)明配合該產(chǎn)品所使用的分析方法并進(jìn)行驗證，如不同平臺方法、不同軟件分析、操作注意事項等。

（4）不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

（5）質(zhì)量控制：同型陰性對照、正常成人樣本對照、商業(yè)化陽(yáng)性質(zhì)控品、熒光信號與散射光結合對各細胞群的確認等。

（七）分析性能評估資料

申請人應提交企業(yè)在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，對于每項性能的評價(jià)，都應包括研究目的、實(shí)驗設計、可接受標準、實(shí)驗數據、統計方法等詳細資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實(shí)驗地點(diǎn)（實(shí)驗室）、適用儀器、所用軟件、臨床樣本來(lái)源等。對用于多色流式細胞分析的試劑（如CD3/CD4/CD8淋巴細胞亞群檢測試劑），其待測每個(gè)指標（如CD3、CD4和CD8三個(gè)指標）及主要組合形式的所有分析性能均應分別進(jìn)行相關(guān)的驗證。分析性能評價(jià)的實(shí)驗方法可以參考國際或國內有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。

1.準確度

對測量準確度的評價(jià)主要包括：與國家標準品（和/或國際標準品）的偏差分析和方法學(xué)比對兩種方法，企業(yè)可根據實(shí)際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

（1） 國家（國際）標準品的檢測及偏倚情況

如果研究項目有相應國家（國際）標準品，則使用國家（國際）標準品進(jìn)行驗證，重點(diǎn)觀(guān)察對相應標準品檢測結果的偏差情況。

（2）方法學(xué)比對

采用國內/國際普遍認為質(zhì)量較好的已上市同類(lèi)試劑作為參比方法，與擬申報試劑同時(shí)檢測一批樣品，從測定結果間的差異了解擬申報試劑與參比方法間的偏倚。如偏倚很小或在允許的誤差范圍內，說(shuō)明兩檢測系統對病人標本測定結果基本相符，對同一份臨床樣本的醫學(xué)解釋?zhuān)瑪M申報試劑與參比方法相比不會(huì )產(chǎn)生差異結果。方法學(xué)比對時(shí)，企業(yè)應嚴格執行申報試劑和參比試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求，著(zhù)重注意質(zhì)量控制、樣本采集及處理、實(shí)驗參數設置等事項;濃度分布范圍及可接受標準、合理的統計學(xué)分析等要素均應在注冊文件中予以說(shuō)明。

2.精密度：

精密度是指在規定的檢測條件下，相互獨立的測試結果間的一致程度，本類(lèi)試劑的精密度評價(jià)主要考慮細胞計數結果和熒光強度兩方面。建議采用多個(gè)水平的質(zhì)控物質(zhì)用于細胞計數精密度的評價(jià)，各個(gè)濃度均應在試劑盒的線(xiàn)性范圍內且有一定的臨床意義（醫學(xué)決定水平），通常包括該檢測指標的正常范圍、異常低值和高值樣本。企業(yè)可根據不同情況，采用質(zhì)控品、特定細胞株、正?；虍惓Ｈ巳簶颖緛?lái)做精密度評估。

對于質(zhì)控品或校準品的精密度評價(jià)，應包括其所有質(zhì)控或校準項目，如熒光信號及散射光要求等。

在進(jìn)行精密度評價(jià)時(shí)，除申報試劑本身的影響外，還應對操作者、適用機型、不同軟件及實(shí)驗地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。企業(yè)應制定合理的精密度評價(jià)方案，例如：在每個(gè)適用機型上進(jìn)行至少20天（工作日）的連續檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整運行，每天內兩次運行間的時(shí)間間隔不少于3小時(shí)，從而對批內/批間、日間、運行內/運行間、不同操作者間的精密度以及各變量綜合的總精密度進(jìn)行評價(jià)。

3.線(xiàn)性范圍：

本類(lèi)產(chǎn)品線(xiàn)性主要包括稀釋細胞濃度范圍和標記抗體陽(yáng)性細胞的百分率范圍兩種線(xiàn)性范圍。企業(yè)可根據實(shí)際需要及以往的研究習慣自行選擇其中一種對線(xiàn)性的要求進(jìn)行驗證。企業(yè)應對每個(gè)測量參數建立合理的線(xiàn)性范圍，在建立一個(gè)參數的線(xiàn)性范圍時(shí)，應該盡量將預期測定范圍加寬，在合理范圍內選擇7～11個(gè)濃度水平，每個(gè)水平2～4份復制液，取每個(gè)濃度水平重復測量的均值用于線(xiàn)性回歸分析，依據實(shí)驗結果逐漸減少數據點(diǎn)直至表現出最寬的線(xiàn)性范圍，如采用回歸方法統計線(xiàn)性分析的結果，則擬合回歸直線(xiàn)的判定系數（R2）應不小于0.95。

建立稀釋細胞濃度線(xiàn)性范圍時(shí)，所用的樣本基質(zhì)應盡可能與臨床實(shí)際檢測的樣本相似，建議采用混合血漿或自體血漿進(jìn)行稀釋?zhuān)瑫r(shí)應考慮多倍稀釋可能造成的基質(zhì)效應。對于標記抗體陽(yáng)性細胞百分率的線(xiàn)性范圍，建議企業(yè)選擇經(jīng)確認的陽(yáng)性細胞株和陰性細胞株按照恒定的細胞總數將兩種細胞進(jìn)行不同比率的混合，陽(yáng)性細胞數與陰性細胞數比例可以從0%到100%不等，從而確認合理的有關(guān)陽(yáng)性細胞百分率的線(xiàn)性范圍。

4.分析特異性

（1）采用多種方法對申報抗體與靶抗原結合的特異性驗證研究，如采用競爭性抑制法、抗體與抗原純品的結合研究、免疫印跡技術(shù)或胞膜抗原的基因轉染技術(shù)等方法對抗原抗體結合的特異性進(jìn)行相關(guān)的驗證;有關(guān)靶抗原的細胞或組織分布特異性的研究，如抗體與不同細胞系的反應譜等。

（2）交叉反應性：通過(guò)實(shí)驗或風(fēng)險分析驗證所申報單克隆抗體除與目標抗原的結合外，是否與樣本中可能存在其他內生或外源物質(zhì)發(fā)生交叉反應，如：與待測抗原有相似化學(xué)結構或抗原表位的蛋白、激素或近期服用的某些藥物等。

（3）干擾：本處所指的干擾是指經(jīng)過(guò)生產(chǎn)商指定的樣本處理方法后，檢測時(shí)是否還存在其他影響結果的干擾因素或干擾物質(zhì)。如有，生產(chǎn)商應進(jìn)行說(shuō)明并驗證（使用醫學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗證）;另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進(jìn)行評價(jià)。

（八）參考值（范圍）確定資料

研究資料應詳細描述用于參考值（范圍）確定健康人群的地域、年齡、性別等特征，并對統計分析方法進(jìn)行詳細解釋?？梢詤⒖紘鴥然驀H有關(guān)參考值（范圍）制定的指南文件推薦的方法進(jìn)行。不同種族、年齡或性別人群如有明顯差異應分別進(jìn)行相關(guān)的統計分析并設置不同的參考值（范圍）。

（九）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩定性（有效期）、高溫加速破壞穩定性、運輸穩定性以及開(kāi)瓶穩定性等研究，申請人可根據實(shí)際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實(shí)施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實(shí)時(shí)穩定性研究，應提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩定性主要考慮染色前和染色后穩定性，前者是指樣本采集后至染色（標記）前的穩定性，后者是指染色（標記）后到上機分析前的穩定性。樣本染色前、染色后穩定性需結合試劑的穩定性研究綜合進(jìn)行考慮，建議在試劑實(shí)時(shí)（效期）穩定性的終止日期后開(kāi)展樣本穩定性的研究，這樣可以代表最差條件的穩定性?？梢栽诤侠淼臏囟确秶鷥冗x擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每間隔一定的時(shí)間段對采集樣本或標記后樣本進(jìn)行陽(yáng)性細胞比例（或絕對數）及熒光強度變化率的分析驗證，從而確認樣本染色前和染色后的合理保存條件和有效期。

試劑穩定性和樣本穩定性?xún)刹糠謨热莸难芯拷Y果均應在說(shuō)明書(shū)【儲存條件及有效期】和【樣本要求】?jì)身椫羞M(jìn)行詳細說(shuō)明。

（十）臨床試驗研究

1.樣本例數

考慮到流式細胞儀配套用檢測試劑種類(lèi)繁多、臨床用途廣泛但主要原材料、生產(chǎn)工藝及檢測原理等非常相似的特點(diǎn)，該類(lèi)試劑臨床試驗研究的總樣本數為不少于500例。

2.臨床研究單位的選擇

流式細胞儀配套用檢測試劑的臨床研究應在三家以上（含三家）省級醫療衛生單位進(jìn)行，對于特殊使用目的產(chǎn)品可以在相應的市級以上專(zhuān)科醫院或其他診療機構開(kāi)展臨床研究。建議在國內不同城市選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定地域代表性;臨床研究單位須具有流式細胞儀專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員及相應的儀器設備，確保該項研究的實(shí)施。實(shí)驗操作人員應有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統的各環(huán)節（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗中，考核試劑和參比試劑都應處于有效的質(zhì)量控制下，定期對儀器進(jìn)行校準，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。流式細胞儀檢測的專(zhuān)業(yè)性較強，實(shí)驗操作人員須接受過(guò)流式細胞儀技術(shù)的專(zhuān)業(yè)培訓，并經(jīng)過(guò)考核合格后上崗，具備實(shí)驗室檢測和臨床病情相結合的流式細胞儀相關(guān)的檢測經(jīng)驗。

3.研究方法

（1）境內已有同類(lèi)試劑批準上市產(chǎn)品的臨床研究：

選擇中國境內已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為對照試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱(chēng)考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗研究，證明考核試劑與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

（2）境內尚無(wú)同類(lèi)試劑批準上市的產(chǎn)品臨床研究：

可以選擇國外已上市、普遍認為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為對照試劑，采用考核試劑與之進(jìn)行對比試驗研究，證明本品與對照試劑等效或優(yōu)于對照試劑。同時(shí)，還應結合每個(gè)患者的臨床病情對申報試劑的檢測結果進(jìn)行綜合判斷，如有必要，需對研究對象進(jìn)行相關(guān)的跟蹤監測研究，以綜合評價(jià)申報試劑的檢測結果，驗證其與臨床病情的一致性。

4.試驗方案

臨床試驗實(shí)施前，研究人員應從流行病學(xué)、統計學(xué)、臨床醫學(xué)、檢驗醫學(xué)等多方面考慮，設計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗過(guò)程中遵循預定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說(shuō)明原因。整個(gè)試驗過(guò)程應在臨床研究機構的實(shí)驗室內并由本實(shí)驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導外，不得隨意干涉實(shí)驗進(jìn)程，尤其是數據收集過(guò)程。

5.臨床病例選擇

絕大多數采用流式細胞儀方法檢測的血細胞或組織細胞抗原對于疾病診斷的靈敏度和特異性較低，與器官/組織定位、疾病良惡性區分以及與病情的進(jìn)展程度雖有一定關(guān)聯(lián)但多無(wú)明確的量值-病情相關(guān)關(guān)系，而且，多數情況下，該類(lèi)試劑在用于病變的診療時(shí)需要多個(gè)標記物組合檢測才能體現其臨床意義。因此，在進(jìn)行臨床研究時(shí)，除有針對性選擇目的性較強的病例外，還應選擇部分其他相關(guān)的抗原表達類(lèi)似或需鑒別診斷的病例。

臨床研究試驗中應包括對部分來(lái)自健康人群的樣本作為正常對照。驗證試劑的正常參考值（范圍），比較正常組和疾病組結果，以便對申報產(chǎn)品的臨床性能作出全面分析。建議對健康人群例數的選擇以不超過(guò)120例為宜。對于臨床意義有待明確或發(fā)病率極低（陽(yáng)性樣本較難獲得）的試劑，可適當增加正常樣本數。不管是健康人群或不同病種的患者，每一組受試者的最小入選人數均須滿(mǎn)足統計學(xué)分析的基本要求。

6.結果差異樣本的驗證

數據分析時(shí)，對于兩種試劑的檢測結果有明顯差異或與臨床方案中的標準出現偏差的樣本，臨床試驗研究人員應對差異原因進(jìn)行合理分析，包括樣本處理、檢測操作、設門(mén)/分析過(guò)程中可能出現的干擾或錯誤，差異樣本亦可能由于樣本的個(gè)體差異所致。如果經(jīng)綜合分析無(wú)法確認差異原因，且偏差樣本有統計學(xué)意義，則應進(jìn)行必要的重復檢測并采用公認的“金標準”方法或第三方試劑進(jìn)行復核。

7.統計方法：對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如相關(guān)分析、線(xiàn)性回歸、生存分析、受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)分析等。對于對比實(shí)驗的等效性研究，最常用是對實(shí)驗試劑和對照試劑的兩組檢測結果的相關(guān)及線(xiàn)性回歸分析，如適用，應重點(diǎn)觀(guān)察相關(guān)系數（r值）或判定系數（R2）、回歸方程斜率（b）及y軸截距（a）等指標。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價(jià)實(shí)驗試劑與對照試劑是否等效的標準。

8.臨床試驗結果報告

根據《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應該對整個(gè)臨床試驗實(shí)施過(guò)程、結果分析、結論等進(jìn)行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進(jìn)行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標準、不同病種的預期選擇例數及健康人群的選擇標準。

③樣本類(lèi)型，樣本的收集、處理及保存等。

④統計學(xué)方法、統計軟件、評價(jià)統計結果的標準。

（2）具體的臨床試驗情況

①考核試劑和參比試劑的名稱(chēng)、批號、有效期及所用機型等信息;考核試劑該批次自檢或經(jīng)其他機構檢測合格情況;參比試劑的境內外批準情況等信息。

②對各研究單位的病例數、病種分布情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品回收（或測量值）、抽查結果評估。

④具體試驗過(guò)程，樣本檢測、數據收集、樣本長(cháng)期保存、結果不一致樣本的校驗等。

（3）統計學(xué)分析

①數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對方案的修改。

②相關(guān)性和一致性分析

可以采用線(xiàn)性回歸的方式驗證兩種試劑結果的相關(guān)性，以y=a+bx和R2的形式列出回歸分析的擬合方程，其中：y是考核試劑結果，x是參比試劑結果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數，同時(shí)應給出b的95%（或99%）置信區間，定量值結果應無(wú)明顯統計學(xué)差異。

另外考慮到某些檢測指標在不同的樣本濃度區間、不同年齡段人群或不同疾病來(lái)源的樣本可能有較明顯的差異，因此，如有必要，建議以上述相關(guān)要素為依據分組并對各組數據分別進(jìn)行統計分析，以更好的驗證兩種試劑的相關(guān)性。

（4）討論和結論

對總體結果進(jìn)行總結性描述并簡(jiǎn)要分析試驗結果，對本次臨床研究有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗結論。

四、名詞解釋

1.準確度（accuracy）：一個(gè)測量值與可接受的參考值間的一致程度。

2.精密度（precision）：在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學(xué)方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

3.線(xiàn)性（linearity）：在給定測量范圍內，給出的測量結果與樣品中實(shí)際存在的被測量物的值成比例的能力。線(xiàn)性是描述一個(gè)測量系統的測量示值或測量結果相關(guān)于樣本的賦值符合直線(xiàn)的屬性。

4.分析特異性（analytical Specificity）：測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測量被測量物的能力。通常以一個(gè)被評估的潛在干擾物清單來(lái)描述，并給出在特定醫學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度（潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物）。

五、參考文獻

1.《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械〔2007〕229號）。

2.《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）。

3.《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）。

4.EP9-A2：Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline-Second Edition （September 2002）。

5.EP5-A2: Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices;Approved Guideline-Second Edition（August 2004）。

6.EP6-A: Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach; Approved Guideline。

7.H20-A2: Reference Leukocyt （WBC） Differential Count （Proportional） and Evaluation of Instrumental Methods; Approved Standard—Second Edition。

8.H42-A2: Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline—Second Edition。

9.H43-A2: Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells: Approved Guideline—Second Edition。

10.H44-A2: Methods for Reticulocyte Counting （Automated Blood Cell Counters, Flow Cytometry, and Supravital Dyes）; Approved Guideline—Second Edition。

11.H52-A: Fetal Red Cell Detection; Approved Guideline。

12.ILA26-A: Performance of Single Cell Immune Response Assays; A pproved Guideline。

13. EP25-A: Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents; Approved Guideline。

14. EP15-A2：User Verification of Performance for Precision and Trueness; Approved Guideline – second edition。

15.王建中，《臨床流式細胞分析》，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社。

16.杜立穎，馮任青：《流式細胞術(shù)》，北京大學(xué)出版社。

17.馮仁豐，《臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎》（第二版），上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社。

18.《中國生物制品規程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社。