新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年第2號(hào)）

附件：新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年第2號(hào)）.doc

新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑
注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“新冠病毒核酸檢測(cè)試劑”）注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為60~140nm。具有5個(gè)必需基因，分別針對(duì)核殼蛋白（N）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴(lài)性的RNA聚合酶（RdRp）。核殼蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜蛋白（E），病毒包膜包埋有膜蛋白（M）、刺突蛋白（S）。

新型冠狀病毒感染實(shí)驗(yàn)室檢查包括一般檢查，病原學(xué)及血清學(xué)檢查。病原學(xué)檢查又包括核酸檢測(cè)和抗原檢測(cè)等。核酸檢測(cè)主要采用熒光PCR方法，在鼻咽拭子、口咽拭子、痰液和其他下呼吸道樣本中檢測(cè)新型冠狀病毒核酸。

新型冠狀病毒在流行過(guò)程中基因組不斷發(fā)生變異，新的變異株可能在傳播力、致病性、免疫逃逸能力等方面發(fā)生改變。變異株可能影響檢測(cè)試劑的性能，甚至出現(xiàn)漏檢風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)密切跟蹤試劑的檢測(cè)能力。

本指導(dǎo)原則適用于采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光 PCR法，對(duì)鼻咽拭子、口咽拭子、痰液或肺泡灌洗液等呼吸道樣本中的新型冠狀病毒(2019-nCoV )核酸進(jìn)行體外定性的檢測(cè)試劑。

對(duì)于采用其他方法學(xué)的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

本指導(dǎo)原則適用于新冠病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則針對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫(xiě)，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱(chēng)及分類(lèi)編碼

產(chǎn)品名稱(chēng)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）及相關(guān)法規(guī)的要求，如新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類(lèi)規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類(lèi)體外診斷試劑管理，分類(lèi)編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測(cè)流程。提供不同適用機(jī)型的檢測(cè)通量，即一次檢測(cè)最多可檢測(cè)的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測(cè)全過(guò)程所需的時(shí)間。不同檢測(cè)流程，分別提供最少和最多檢測(cè)樣本量下的檢測(cè)時(shí)間。與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類(lèi)型，檢測(cè)原理，檢測(cè)靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測(cè)的靶基因，需選擇保守性和特異性相對(duì)較高的基因，同時(shí)還應(yīng)考慮基因的擴(kuò)增效率。具體檢測(cè)基因一般為ORF1ab和N基因，如果檢測(cè)其他基因，應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻(xiàn)，并分析所檢測(cè)基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（2022年第8號(hào)）的要求編寫(xiě)。該類(lèi)產(chǎn)品作為第三類(lèi)體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

新冠病毒核酸檢測(cè)試劑已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。

新冠病毒核酸檢測(cè)試劑的檢出限水平應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)指南文件規(guī)定，申報(bào)產(chǎn)品對(duì)國(guó)家靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與聲稱(chēng)的檢出限水平相當(dāng)。

如有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2. 分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評(píng)估的資料。如申報(bào)產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對(duì)各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。

適用的不同樣本類(lèi)型應(yīng)分別進(jìn)行分析性能研究。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類(lèi)型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的新冠病毒陽(yáng)性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽(yáng)性和濃度水平，提交具體的試驗(yàn)資料。分析性能評(píng)估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本，如涉及稀釋后檢測(cè)，應(yīng)采用與適用樣本類(lèi)型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒進(jìn)行分析性能評(píng)估。對(duì)于各項(xiàng)性能中采用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本，研究?jī)?nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。

如產(chǎn)品適用拭子、痰液等不同的樣本類(lèi)型，因其中干擾物質(zhì)存在較大差異，可能對(duì)病毒RNA降解的影響不同，建議對(duì)每種樣本類(lèi)型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測(cè)，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2.2適用的樣本類(lèi)型

列明產(chǎn)品適用的樣本類(lèi)型。

2.3企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.4精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用臨床樣本進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：待測(cè)物濃度為零，即未感染新型冠狀病毒者的樣本，其檢測(cè)為陰性的比率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.5包容性

2.5.1病毒樣本的驗(yàn)證

驗(yàn)證具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少20個(gè)不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本（臨床樣本或病毒培養(yǎng)物），應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗(yàn)證。樣本應(yīng)覆蓋目前國(guó)內(nèi)流行的變異株型別，并適當(dāng)納入其他代表性的變異株。注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。

2.5.2對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析及樣本驗(yàn)證

按照變異株驗(yàn)證相關(guān)要求進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

將不同來(lái)源的至少5個(gè)新冠病毒樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度最少重復(fù)3次檢測(cè)，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計(jì)檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個(gè)濃度至少重復(fù)20次檢測(cè)，通過(guò)直接檢測(cè)或者Probit分析計(jì)算，將具有95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

2.6.2檢出限的驗(yàn)證

選擇另外5個(gè)不同來(lái)源的新冠病毒樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應(yīng)

需驗(yàn)證相關(guān)病原體和多例人類(lèi)基因組DNA（表1）的交叉反應(yīng)。除SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒可采用假病毒外，各病原體均應(yīng)采用臨床樣本或培養(yǎng)物進(jìn)行驗(yàn)證。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體樣本的來(lái)源、陰陽(yáng)性、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

2.7.2競(jìng)爭(zhēng)性干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上容易與新冠病毒合并感染的病原體，在高濃度的情況下對(duì)低濃度（例如檢出限濃度）新冠病毒核酸檢測(cè)的影響，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性干擾研究。

2.7.3干擾試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類(lèi)型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)包含臨界陽(yáng)性水平在內(nèi)的新冠病毒樣本。對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測(cè)的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

2.8核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

2.9反應(yīng)體系

2.9.1樣本采集和處理

2.9.1.1樣本采集方式的選擇

2.9.1.2樣本采集時(shí)間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

2.9.1.3采樣拭子及樣本保存液的選擇：對(duì)拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗(yàn)證檢出限和重復(fù)性。

2.9.1.4樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，研究?jī)?nèi)容包括胍鹽的使用濃度及用量、樣本用量。如適用，對(duì)痰液消化方式及消化液進(jìn)行研究。

2.9.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測(cè)靈敏度。

反應(yīng)體系研究應(yīng)確保不同基因的檢測(cè)能力具有一致性，對(duì)于結(jié)果為單基因陽(yáng)性時(shí)需要復(fù)測(cè)的試劑，需使用至少10例臨床樣本梯度稀釋?zhuān)^察各基因檢出情況是否存在顯著差異，避免過(guò)高的復(fù)測(cè)率。

提交不同適用機(jī)型基線(xiàn)和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3. 穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值一般為申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)病毒核酸陽(yáng)性的Ct值。陽(yáng)性判斷值研究用樣本來(lái)源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時(shí)間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽(yáng)性樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。采用ROC曲線(xiàn)分析建立每個(gè)檢測(cè)靶基因的陽(yáng)性判斷值，然后確定產(chǎn)品的判讀規(guī)則（單基因陽(yáng)性、雙基因陽(yáng)性等）。對(duì)于結(jié)果為單基因陽(yáng)性時(shí)需要復(fù)測(cè)的試劑，建議對(duì)陽(yáng)性判斷值研究數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)測(cè)率的統(tǒng)計(jì)分析。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類(lèi)型，需要對(duì)各樣本類(lèi)型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。

提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來(lái)源機(jī)構(gòu)、檢測(cè)結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類(lèi)產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠(chǎng)檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對(duì)和功能性試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，其中序列比對(duì)包括與已公布新冠病毒序列的比對(duì)，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對(duì)；功能性試驗(yàn)包括對(duì)不同來(lái)源、不同滴度的新冠病毒核酸陽(yáng)性樣本，和不同的近緣病原體的檢測(cè)。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實(shí)驗(yàn)等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測(cè)的靶序列，可采用假病毒制備，建議采用弱陽(yáng)性濃度水平。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過(guò)程，以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱(chēng)內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

5.1.6企業(yè)參考品

該類(lèi)產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽(yáng)性參考品：應(yīng)著重考慮不同來(lái)源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來(lái)源的5個(gè)病毒樣本。

陰性參考品：主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

該類(lèi)試劑應(yīng)通過(guò)臨床試驗(yàn)路徑進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。臨床試驗(yàn)應(yīng)滿(mǎn)足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類(lèi)試劑臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

該類(lèi)試劑臨床試驗(yàn)應(yīng)按要求在三家以上臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，開(kāi)展臨床試驗(yàn)的機(jī)構(gòu)應(yīng)按要求經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)備案系統(tǒng)備案。

1. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比較研究，從而對(duì)產(chǎn)品臨床性能進(jìn)行確認(rèn)。

2. 受試者選擇

臨床試驗(yàn)的入組人群應(yīng)為產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群包括：有新冠感染相關(guān)癥狀的就診患者及重癥高風(fēng)險(xiǎn)住院患者，以及根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)相關(guān)規(guī)定需進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)的其他人群。臨床試驗(yàn)入組人群應(yīng)能代表適用人群的各種情形，如：最終確診感染病例應(yīng)包括不同病毒載量（根據(jù)對(duì)比試劑核酸檢測(cè)結(jié)果確定）的病例，最終非新冠感染病例應(yīng)適當(dāng)納入有相似癥狀的其他呼吸道病原體感染病例。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布了新型冠狀病毒感染診療方案、《新型冠狀病毒感染“乙類(lèi)乙管”檢測(cè)方案》和其他相關(guān)文件，申請(qǐng)人在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮現(xiàn)行方案對(duì)檢測(cè)對(duì)象的規(guī)定，按照規(guī)定入組病例進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

3. 臨床試驗(yàn)樣本要求

試驗(yàn)體外診斷試劑可同時(shí)適用于上呼吸道樣本和下呼吸道樣本，也可僅適用于上呼吸道樣本。建議按照《新冠病毒樣本采集和檢測(cè)技術(shù)指南》進(jìn)行樣本采集。

應(yīng)采用臨床原始樣本進(jìn)行臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)所用樣本類(lèi)型、樣本采集、樣本處理、樣本穩(wěn)定性、核酸提取純化及結(jié)果判讀等應(yīng)分別滿(mǎn)足試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求，并在臨床試驗(yàn)小結(jié)和報(bào)告中明確上述內(nèi)容。臨床試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)行充分的性能評(píng)估。

4. 臨床試驗(yàn)樣本量

應(yīng)基于與對(duì)比試劑的比較研究估算臨床試驗(yàn)樣本量。根據(jù)已有研究數(shù)據(jù)進(jìn)行初步估算，建議對(duì)比試劑（核酸檢測(cè)試劑）檢測(cè)陽(yáng)性樣本不少于200例，陰性樣本不少于300例。如涉及多種樣本類(lèi)型，每種樣本類(lèi)型的陽(yáng)性和陰性樣本例數(shù)建議均不少于70例。

應(yīng)包括至少50例由對(duì)比試劑任一基因確定為弱陽(yáng)性的樣本(一般將任一基因的Ct值小于cutoff值3～5個(gè)Ct值的樣本定義為弱陽(yáng)性樣本)，如涉及多種樣本類(lèi)型，弱陽(yáng)性樣本應(yīng)覆蓋每種樣本類(lèi)型。

5. 對(duì)比方法

應(yīng)選擇質(zhì)量較好的已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑。

試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比試劑應(yīng)針對(duì)同一份樣本或同步采集的相同樣本類(lèi)型的樣本（采樣順序應(yīng)隨機(jī)）進(jìn)行檢測(cè)。若尚無(wú)相同樣本類(lèi)型的核酸檢測(cè)試劑批準(zhǔn)上市，也可選擇同源的、可比的樣本，進(jìn)行對(duì)比試劑的檢測(cè)。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比試劑的可比性進(jìn)行充分的論證。對(duì)于新的樣本類(lèi)型，申請(qǐng)人還應(yīng)對(duì)新樣本類(lèi)型的適用性及其與對(duì)比試劑檢測(cè)時(shí)所用同源樣本類(lèi)型的可比性進(jìn)行充分論證。

6. 統(tǒng)計(jì)分析

6.1描述性統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)對(duì)入組人群進(jìn)行人口學(xué)分析，包括年齡、性別和臨床診斷背景信息等。

6.2與對(duì)比試劑的總體一致性統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析一般以2×2表的形式對(duì)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計(jì)算陰性符合率、陽(yáng)性符合率、總符合率及其95%置信區(qū)間。

7. 其他

7.1如試驗(yàn)體外診斷試劑同時(shí)適用于快檢機(jī)型和常規(guī)機(jī)型，且經(jīng)臨床前驗(yàn)證試驗(yàn)體外診斷試劑在快檢機(jī)型與常規(guī)機(jī)型上的檢測(cè)性能沒(méi)有顯著差異，但在樣本提取純化或反應(yīng)體系等方面存在明顯差異，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間上存在明顯差異的，建議以代表性快檢機(jī)型為主機(jī)型進(jìn)行臨床試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行一定數(shù)量的代表性快檢機(jī)型與代表性常規(guī)機(jī)型之間的比較研究。

7.2如試驗(yàn)體外診斷試劑為包括新冠項(xiàng)目的多項(xiàng)聯(lián)檢試劑，應(yīng)考慮聯(lián)檢的臨床意義，確認(rèn)多項(xiàng)聯(lián)檢試劑具有相同的適用人群，采用相同的樣本類(lèi)型。多項(xiàng)聯(lián)檢時(shí)，每個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)均應(yīng)滿(mǎn)足相應(yīng)指導(dǎo)原則的要求。每個(gè)項(xiàng)目均應(yīng)按照試驗(yàn)體外診斷試劑和對(duì)比試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如：樣本采集、保存液/采樣液/處理液和核酸提取純化試劑等的要求。

7.3如試驗(yàn)體外診斷試劑包括不同樣本類(lèi)型，針對(duì)每種樣本類(lèi)型，可參考6.2 的相關(guān)內(nèi)容，分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。針對(duì)總體統(tǒng)計(jì)分析及樣本類(lèi)型的分層統(tǒng)計(jì)分析，臨床試驗(yàn)結(jié)果均應(yīng)滿(mǎn)足臨床使用需求。

7.4針對(duì)不一致結(jié)果，應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀和疾病轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。

7.5此外，還應(yīng)關(guān)注并計(jì)算試驗(yàn)體外診斷試劑的復(fù)測(cè)率。申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合臨床使用需求，嚴(yán)格控制復(fù)測(cè)率。

8. 境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗(yàn)方案、報(bào)告和倫理審查意見(jiàn)，以及該數(shù)據(jù)適用于中國(guó)患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異的對(duì)比資料和臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異對(duì)于臨床試驗(yàn)結(jié)果影響的論證資料。

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗(yàn)技術(shù)審評(píng)要求，論證境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的充分性。

9. 臨床評(píng)價(jià)資料的形式要求

申請(qǐng)人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》、《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)遞交要求注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》等法規(guī)文件要求提交臨床評(píng)價(jià)綜述、各機(jī)構(gòu)倫理審查意見(jiàn)、臨床試驗(yàn)方案、臨床試驗(yàn)小結(jié)、臨床試驗(yàn)報(bào)告及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)等。

臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表作為臨床試驗(yàn)小結(jié)的附件提交。數(shù)據(jù)表應(yīng)包括唯一可追溯的樣本編號(hào)、年齡、性別、樣本類(lèi)型、受試者臨床診斷背景信息、新型冠狀病毒感染的診斷結(jié)果、試驗(yàn)體外診斷試劑的檢測(cè)結(jié)果和對(duì)比試劑的檢測(cè)結(jié)果（如：各基因和內(nèi)標(biāo)的Ct值）等。具體內(nèi)容詳見(jiàn)附表。

其中，受試者臨床診斷背景信息應(yīng)盡量收集各病例的流行病學(xué)史，臨床表現(xiàn)如體征、癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查包括一般檢查和病原學(xué)與血清學(xué)檢查，特別是臨床診療過(guò)程中新冠病毒核酸的檢測(cè)時(shí)間和結(jié)果等。應(yīng)在各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)隨機(jī)選擇至少50個(gè)樣本（包括強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)和所有弱陽(yáng)性樣本），提交試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比試劑的檢測(cè)圖譜。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)格式應(yīng)滿(mǎn)足《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。新冠病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1．【預(yù)期用途】

本試劑盒用于體外定性檢測(cè)具有新型冠狀病毒感染相關(guān)癥狀人群、其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者的xx樣本中，新型冠狀病毒（2019-nCoV）xx基因。

本試劑盒檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、其他實(shí)驗(yàn)室檢查等進(jìn)行綜合分析，作出診斷。

該產(chǎn)品在使用上應(yīng)當(dāng)遵守新型冠狀病毒感染診療方案等文件的相關(guān)要求。

開(kāi)展新型冠狀病毒核酸檢測(cè)，應(yīng)符合新冠病毒樣本采集和檢測(cè)技術(shù)相關(guān)指南的要求，做好生物安全工作。

2.【檢驗(yàn)原理】

簡(jiǎn)述產(chǎn)品的核酸提取和RT-PCR原理。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱(chēng)及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑，病毒保存液，痰液消化液等的產(chǎn)品名稱(chēng)，生產(chǎn)廠(chǎng)家，貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【樣本要求】

需詳細(xì)描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，適用的拭子材質(zhì)，保存液、消化液的使用體積，滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

5.【檢驗(yàn)方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品與待測(cè)樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍，作為實(shí)驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

6.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽(yáng)性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽(yáng)性、復(fù)測(cè)、無(wú)效等所有情形。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

7.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

7.2有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析

7.2.1 如果樣本在運(yùn)輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

7.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存及處理、樣本中病原體含量過(guò)低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.2該病原體待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.3 未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

8.1國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和企業(yè)參考品的符合率。

8.2檢出限：簡(jiǎn)要介紹評(píng)價(jià)方法、所用樣本情況以及評(píng)價(jià)結(jié)果。

8.3對(duì)包容性的研究情況進(jìn)行總結(jié)。描述新冠病毒變異株對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果的影響，例如影響產(chǎn)品的檢出限或者導(dǎo)致單基因檢測(cè)陽(yáng)性等。

8.4對(duì)精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

8.5分析特異性

8.5.1交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類(lèi)，及有/無(wú)交叉反應(yīng)的濃度水平。

8.5.2干擾試驗(yàn)：說(shuō)明驗(yàn)證的干擾物質(zhì)種類(lèi)及有/無(wú)干擾反應(yīng)的濃度水平。

8.6臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

9.【注意事項(xiàng)】

9.1臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室要求及《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)》（試行第二版）執(zhí)行。

9.2試劑保存運(yùn)輸及使用過(guò)程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過(guò)程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。因拭子等樣本采集過(guò)程及病毒感染過(guò)程本身的特點(diǎn)，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來(lái)的假陰性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時(shí)復(fù)測(cè)。

9.3生物安全防護(hù)相關(guān)內(nèi)容

9.4避免實(shí)驗(yàn)室污染的措施

三、參考文獻(xiàn)

1.《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）[Z].

2.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)）[Z].

3. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì). 新型冠狀病毒感染診療方案（試行第十版）[Z]. 2023-01-06.

4.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì).新型冠狀病毒感染“乙類(lèi)乙管”檢測(cè)方案 [Z].2022-12-27.