乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年第16號(hào)）

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乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑
注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿(mǎn)足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

（一）臨床背景

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的流行強(qiáng)度差異很大。全國(guó)2006年乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)1-59歲一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性率為7.18%，2014年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心開(kāi)展的全國(guó)1—29歲人群乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1—4歲、5—14歲、15—29歲人群HBsAg陽(yáng)性率分別為0.32%、0.94%和4.38%，我國(guó)現(xiàn)有HBV感染者約有8000萬(wàn)。在臨床治療慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒藥物是最主要的手段。抗HBV藥物主要包括干擾素α和核苷（酸）類(lèi)似物兩大類(lèi)，其中核苷（酸）類(lèi)藥物服用便捷，抗病毒效力強(qiáng)，不良反應(yīng)較小，但核苷（酸）類(lèi)藥物在抗HBV治療中需要長(zhǎng)期服藥，一旦出現(xiàn)病毒耐藥，可能導(dǎo)致治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化甚至肝衰竭。因此，如何發(fā)現(xiàn)病毒耐藥突變，進(jìn)而合理調(diào)整治療方案，在慢性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的意義。

HBV屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因組含有4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀框（ORF），即前-S/S區(qū)、前-C/C 區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。其中P區(qū)編碼聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，目前已知的核苷（酸）類(lèi)藥物的耐藥突變均發(fā)生在HBV的P區(qū)。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復(fù)制需經(jīng)過(guò)以前基因組RNA為復(fù)制中間體的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在此過(guò)程中，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶由于缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，導(dǎo)致HBV復(fù)制過(guò)程中核苷酸錯(cuò)配率較高。HBV復(fù)制的這種過(guò)程和特點(diǎn)，導(dǎo)致同一患者體內(nèi)不同的HBV株基因序列之間也存在差異，因此，每一個(gè)患者體內(nèi)的病毒都是由不同基因序列的病毒株組成的動(dòng)態(tài)變化的病毒準(zhǔn)種，不同基因序列的病毒株在病毒準(zhǔn)種中所占的相對(duì)比例，一方面取決于病毒株自身的復(fù)制能力，另一方面也受到機(jī)體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力的影響。

抗病毒藥物核苷（酸）類(lèi)似物進(jìn)入機(jī)體后，形成三磷酸活性成分，與機(jī)體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止。如果患者體內(nèi)的HBV P區(qū)序列發(fā)生突變，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類(lèi)似物結(jié)合力降低，突變的HBV即不受核苷（酸）類(lèi)似物的抑制或抑制能力下降，在繼續(xù)應(yīng)用核苷（酸）類(lèi)似物治療的情況下，突變株病毒由于對(duì)核苷（酸）類(lèi)似物不敏感而逐漸成為優(yōu)勢(shì)株，從而導(dǎo)致患者對(duì)于核苷（酸）類(lèi)似物的耐藥。

乙型肝炎病毒的耐藥突變分為原發(fā)性耐藥突變和補(bǔ)償性耐藥突變，原發(fā)性耐藥突變指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致突變病毒株對(duì)治療藥物的敏感性下降。雖然原發(fā)性耐藥突變株對(duì)藥物的抵抗性增加，但也常導(dǎo)致突變病毒本身的復(fù)制能力下降。補(bǔ)償性耐藥突變指由于原發(fā)性耐藥突變病毒株復(fù)制能力下降，在原發(fā)性耐藥突變的基礎(chǔ)上，病毒株在其它位點(diǎn)發(fā)生突變，這些突變可部分恢復(fù)突變病毒的復(fù)制能力或可導(dǎo)致突變病毒對(duì)藥物敏感性的進(jìn)一步下降。

目前經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于抗HBV治療的核苷（酸）類(lèi)似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋酯（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）等。與拉米夫定常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)閞tM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨(dú)出現(xiàn)。與阿德福韋酯常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)閞tN236T與rtA181V/T，兩個(gè)位點(diǎn)可單獨(dú)或聯(lián)合出現(xiàn)。與恩替卡韋常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變是在rtM204V+rtL180M基礎(chǔ)上，再聯(lián)合rtT184、rtS202或rtM250三個(gè)位點(diǎn)中至少一個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代突變。與替比夫定常見(jiàn)耐藥相關(guān)的突變?yōu)閞tM204I，其它位點(diǎn)如rtA181V/T等尚存在爭(zhēng)議。替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋目前尚未發(fā)現(xiàn)確認(rèn)的耐藥突變。

HBV耐藥相關(guān)的檢測(cè)主要包括基因型耐藥檢測(cè)和體外表型分析等。

HBV基因型耐藥檢測(cè)是指采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)已在體外表型分析中被證實(shí)與抗病毒藥物耐藥相關(guān)的HBV突變的臨床檢測(cè)。目前已批準(zhǔn)產(chǎn)品采用的方法主要包括：PCR-測(cè)序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向雜交法（PCR-reverse hybridization assay）、實(shí)時(shí)熒光PCR法（real-time PCR）等。

HBV體外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公認(rèn)的確認(rèn)耐藥的檢測(cè)方法，通過(guò)體外復(fù)制系統(tǒng)證實(shí)檢測(cè)到的HBV突變會(huì)降低其對(duì)抗病毒藥物的敏感性，常用半數(shù)有效濃度（50% effective concentration，EC50）或半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）來(lái)評(píng)價(jià)耐藥程度的高低。其方法是將含有待檢測(cè)耐藥突變位點(diǎn)的HBV全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，再將不同濃度梯度的核苷（酸）類(lèi)似物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過(guò)一定培養(yǎng)時(shí)間后檢測(cè)藥物作用下HBV DNA的復(fù)制情況，計(jì)算EC50，通過(guò)與野生株病毒的EC50比較，判斷該突變對(duì)核苷（酸）類(lèi)似物的敏感性。當(dāng)抑制病毒復(fù)制所需的EC50與野生株相比增加l00倍以上稱(chēng)為高度耐藥、l0—99倍為中度耐藥、2—9倍為輕度耐藥。

（二）本指導(dǎo)原則適用范圍

本指導(dǎo)原則所述乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)人體血清/血漿樣本中乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行定性檢測(cè)的試劑。臨床適用人群為核苷（酸）類(lèi)似物治療過(guò)程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的患者。除非有明確證據(jù)表明初治患者感染HBV來(lái)自接受核苷（酸）類(lèi)似物抗病毒治療患者，一般不主張對(duì)初治患者進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)。

本指導(dǎo)原則是基于實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)產(chǎn)品相關(guān)申報(bào)資料提出要求，其他方法學(xué)的產(chǎn)品可依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用，如不適用，可另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評(píng)價(jià)方法。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及同類(lèi)產(chǎn)品批準(zhǔn)上市情況及異同比較等內(nèi)容，其中，預(yù)期用途應(yīng)明確所檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)，所檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)與相應(yīng)藥物的相關(guān)性，該突變位點(diǎn)為原發(fā)性耐藥突變還是補(bǔ)償性耐藥突變，耐藥性突變對(duì)藥物敏感性的影響，相應(yīng)藥物累積耐藥發(fā)生率以及是否有交叉耐藥等。同類(lèi)產(chǎn)品情況應(yīng)著重從所檢耐藥突變位點(diǎn)、相關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況以及境內(nèi)外批準(zhǔn)上市情況等方面闡述申請(qǐng)注冊(cè)產(chǎn)品與境內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品的異同等。對(duì)于新的耐藥突變位點(diǎn)，需要提供新位點(diǎn)與預(yù)期藥物敏感性之間關(guān)系的文獻(xiàn)資料，包括但不限于國(guó)內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)，以及基于中國(guó)人群的充分的臨床數(shù)據(jù)等。

綜述資料的撰寫(xiě)應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)44號(hào)公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料

以實(shí)時(shí)熒光PCR方法為例，應(yīng)提供引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）等主要原材料的選擇與來(lái)源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料、質(zhì)控品的確認(rèn)試驗(yàn)資料以及企業(yè)參考品的原材料選擇、來(lái)源、質(zhì)量指標(biāo)、制備方法及陰陽(yáng)性的確認(rèn)過(guò)程等的研究資料。

若主要原材料為企業(yè)自行生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提交主要原材料制備過(guò)程的研究資料；如主要原材料購(gòu)自其他供應(yīng)商，則需針對(duì)供應(yīng)商的選擇提供評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，并提供供應(yīng)商出具的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及申請(qǐng)人對(duì)該原材料進(jìn)行的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

1. 核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)驗(yàn)證資料。

2. 引物和探針：包括申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)靶序列的引物和探針以及內(nèi)對(duì)照的引物和探針。應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)和篩選的過(guò)程，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實(shí)驗(yàn)等。

3. 酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

3.1 DNA聚合酶應(yīng)包括DNA聚合酶活性、無(wú)核酸內(nèi)切酶活性、熱啟動(dòng)能力（如適用）、熱穩(wěn)定性等。

3.2如申報(bào)產(chǎn)品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應(yīng)對(duì)其酶活性及熱穩(wěn)定性等質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)定，如使用其他工具酶，應(yīng)提供其詳細(xì)的研究資料。

4. dNTP：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括純度、濃度、保存穩(wěn)定性及功能性實(shí)驗(yàn)等。

5. 試劑盒質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品，質(zhì)控體系主要包括陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和內(nèi)對(duì)照。申請(qǐng)人應(yīng)明確質(zhì)控品的原料來(lái)源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品陰陽(yáng)性的確認(rèn)方法，并提交相關(guān)驗(yàn)證資料。各種質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本處理和檢測(cè)的全過(guò)程，如核酸的平行提取等步驟，并且與被測(cè)臨床樣本在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中保持相同的檢測(cè)方式，質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與實(shí)際檢測(cè)樣本基質(zhì)一致或接近。

有關(guān)質(zhì)控品和內(nèi)對(duì)照的具體要求包括以下幾個(gè)方面：

5.1陽(yáng)性質(zhì)控品中應(yīng)包含試劑盒所檢測(cè)的主要突變類(lèi)型，建議采用含有滅活乙肝病毒或假病毒的樣本。企業(yè)應(yīng)對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求（如Ct值）。

5.2陰性質(zhì)控品應(yīng)包含未發(fā)生耐藥突變的野生型乙肝病毒核酸，可采用含有滅活乙肝病毒或假病毒的樣本，對(duì)可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

5.3內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計(jì)和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線(xiàn)又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。對(duì)內(nèi)對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果亦應(yīng)做出明確的范圍要求（如Ct值）。

6. 企業(yè)參考品：應(yīng)提交有關(guān)企業(yè)參考品的原料選擇、制備、陰陽(yáng)性確認(rèn)等試驗(yàn)資料。企業(yè)參考品應(yīng)充分考慮產(chǎn)品性能驗(yàn)證的需要進(jìn)行設(shè)置。具體要求如下：

6.1陽(yáng)性參考品

陽(yáng)性參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、待測(cè)乙肝病毒耐藥突變陽(yáng)性的樣本，通過(guò)測(cè)序、同類(lèi)已上市產(chǎn)品檢測(cè)或者其他恰當(dāng)?shù)姆椒ù_認(rèn)耐藥突變情況。陽(yáng)性參考品應(yīng)包含試劑盒所能檢測(cè)的所有耐藥突變位點(diǎn)，對(duì)于罕見(jiàn)突變型或復(fù)雜突變型可采用假病毒樣本。

6.2陰性參考品

陰性參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、確認(rèn)靶序列未發(fā)生待測(cè)突變的乙肝病毒陽(yáng)性樣本，樣本類(lèi)型與適用樣本類(lèi)型一致。同時(shí)應(yīng)盡量包含適用范圍以外的其它乙肝病毒基因突變陽(yáng)性樣本，和其它病原體陽(yáng)性樣本。

6.3檢測(cè)限參考品

可選擇最低檢測(cè)限水平或略高于檢測(cè)限的水平，明確參考品中乙肝病毒核酸濃度和乙肝病毒基因突變百分率，應(yīng)包含所有的耐藥突變位點(diǎn)，采用適當(dāng)?shù)年?yáng)性檢出率（如95%（n≥20））作為最低檢測(cè)限參考品的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)限參考品可采用經(jīng)滅活的、待測(cè)乙肝病毒耐藥突變陽(yáng)性樣本和假病毒等模擬核酸樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐渲啤?

6.4精密度參考品

精密度參考品應(yīng)包含申報(bào)產(chǎn)品聲稱(chēng)的主要耐藥突變位點(diǎn)，試劑盒包含不同反應(yīng)體系時(shí)，精密度參考品應(yīng)至少包含每個(gè)反應(yīng)體系的代表性位點(diǎn)，并至少包括弱陽(yáng)性（低濃度突變）水平。精密度參考品制備應(yīng)采用經(jīng)滅活的、待測(cè)乙肝病毒耐藥突變陽(yáng)性的樣本。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1. 介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2. 反應(yīng)原理介紹。

3. 詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

4. 確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本類(lèi)型、樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。

5. 不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

6. 如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能評(píng)價(jià)的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、試驗(yàn)方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)和臨床樣本來(lái)源等。

分析性能評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)批準(zhǔn)指南（CLSI-EP）文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。各項(xiàng)性能評(píng)價(jià)應(yīng)符合以下要求。

1. 核酸分離/純化性能（如適用）

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測(cè)試劑的特性，對(duì)配合使用的核酸分離/純化試劑針對(duì)聲稱(chēng)樣本類(lèi)型的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2. 準(zhǔn)確度

采用多份包含及不包含待測(cè)突變位點(diǎn)的HBV核酸陽(yáng)性臨床樣本，將試驗(yàn)用體外診斷試劑與Sanger測(cè)序或已上市同類(lèi)產(chǎn)品等進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果一致性。樣本應(yīng)包括所有陽(yáng)性突變位點(diǎn)，并包含不同濃度水平。

考慮到同一耐藥突變發(fā)生在不同基因型毒株時(shí)對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響，準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)中應(yīng)適當(dāng)納入各種HBV基因型（至少包括B、C、D型）樣本，若某些基因型的耐藥突變較為罕見(jiàn)，可以采用假病毒樣本。

3. 最低檢測(cè)限

針對(duì)所有待測(cè)突變位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，建議采用95%（n≥20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品，擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的耐藥突變序列所占百分率和總核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響較大，終體系中耐藥突變序列所占百分率越高、所含的總DNA量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)主要考慮以下兩個(gè)方面。

3.1在擴(kuò)增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，耐藥突變序列所占百分率的最低檢測(cè)限。

采用野生型臨床樣本和具有目標(biāo)基因突變的假病毒樣本提取的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行不同比例混合，確定擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的核酸濃度，并逐漸調(diào)整野生型和耐藥突變型核酸儲(chǔ)備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液。對(duì)各份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率水平下的最低百分率，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測(cè)到的最低的突變序列百分率。

3.2在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃度的最低檢測(cè)限。

采用野生型臨床樣本和具有目標(biāo)基因突變的假病毒樣本提取的核酸儲(chǔ)備液進(jìn)行特定比例混合，再逐級(jí)稀釋成不同核酸濃度樣本，分別對(duì)各梯度濃度樣本進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率的最低核酸濃度。

4.精密度

應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)的接受標(biāo)準(zhǔn)做出合理規(guī)定，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)本類(lèi)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求：

4.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、時(shí)間、地點(diǎn)、檢測(cè)輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

4.2應(yīng)針對(duì)所有待測(cè)突變位點(diǎn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證。使用臨床樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)，樣本濃度水平應(yīng)至少包含弱陽(yáng)性和中/強(qiáng)陽(yáng)性，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，精密度評(píng)價(jià)中的每一次檢測(cè)均應(yīng)從核酸提取開(kāi)始。

4.3合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5.分析特異性

5.1交叉反應(yīng)

HBV耐藥突變檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證應(yīng)考慮HBV各種基因突變及其它病原體的交叉反應(yīng)性，申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體、臨床樣本的來(lái)源、種屬、型別、基因突變情況和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

5.1.1核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的其它病原體，或待檢測(cè)樣本中可能共存的其它病原體核酸的交叉反應(yīng)，應(yīng)采用待測(cè)核酸序列陰性、其它核酸高濃度樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，如：人類(lèi)免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人巨細(xì)胞病毒、E-B病毒、梅毒螺旋體、人類(lèi)皰疹病毒6型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、甲型流感病毒、痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等。

5.1.2申報(bào)產(chǎn)品包含的不同耐藥突變位點(diǎn)之間的交叉反應(yīng)，以及申報(bào)產(chǎn)品不包含的其它HBV基因突變對(duì)被檢測(cè)位點(diǎn)的影響等。如：rtL180M、rtA181V/T、rtT184、rtS202、rtM204I/V、rtN236T、rtM250等突變位點(diǎn)之間的交叉反應(yīng)。

5.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)。

5.2.1內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等。

5.2.2外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

5.2.3建議在待測(cè)核酸的臨界值水平對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測(cè)，并針對(duì)各種耐藥突變序列分別進(jìn)行評(píng)價(jià)。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)無(wú)干擾的最高限值。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

對(duì)于此類(lèi)試劑，陽(yáng)性判斷值即為針對(duì)每個(gè)突變基因能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對(duì)于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）的方式進(jìn)行相關(guān)研究。申請(qǐng)人應(yīng)選取適當(dāng)?shù)淖銐驍?shù)量的臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)以確定陽(yáng)性判斷值。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩(wěn)定性研究，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類(lèi)型樣本的穩(wěn)定性。冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)于樣本進(jìn)行核酸提取后不能立即進(jìn)行檢測(cè)的，應(yīng)明確提取核酸的儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存時(shí)間等內(nèi)容，同時(shí)應(yīng)提供相應(yīng)的核酸穩(wěn)定性研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性?xún)刹糠謨?nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料

申請(qǐng)人應(yīng)參考YY/T 0316《醫(yī)療器械 風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用》規(guī)定的過(guò)程和方法，在產(chǎn)品生命周期內(nèi)可能造成的危害進(jìn)行識(shí)別，對(duì)每一危害處境的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行判定和評(píng)價(jià)，形成風(fēng)險(xiǎn)管理報(bào)告，控制這些風(fēng)險(xiǎn)并監(jiān)視控制的有效性，充分保證產(chǎn)品的安全性和有效性。

（八）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)的開(kāi)展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫(xiě)等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)方法

1.1已有同類(lèi)產(chǎn)品上市的情形

選擇已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)性能。

對(duì)比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測(cè)性能等方面，確認(rèn)其與試驗(yàn)用體外診斷試劑具有較好的可比性，并提交相應(yīng)的比對(duì)資料。

1.2無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的情形

1.2.1如新的乙肝病毒耐藥突變位點(diǎn)用于乙肝用藥指導(dǎo)已獲行業(yè)認(rèn)可（包括：國(guó)內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)、相關(guān)藥物說(shuō)明書(shū)、臨床應(yīng)用等的認(rèn)可），在無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的情況下，臨床試驗(yàn)中可選擇Sanger測(cè)序法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄗ鳛閷?duì)比方法進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)性能。

1.2.2如新的乙肝病毒耐藥突變位點(diǎn)用于乙肝用藥指導(dǎo)尚未獲行業(yè)認(rèn)可，臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)康?，耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)性能評(píng)價(jià)及耐藥突變與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評(píng)價(jià)。耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)性能評(píng)價(jià)可參考1.2.1的試驗(yàn)方法，耐藥突變與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評(píng)價(jià)，應(yīng)以體外表型分析作為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)突變位點(diǎn)與體外表型分析的一致性。

針對(duì)Sanger測(cè)序和體外表型分析方法的建立、驗(yàn)證和質(zhì)量控制，應(yīng)提交詳細(xì)的研究論述，相關(guān)內(nèi)容納入臨床試驗(yàn)報(bào)告中。

2.受試者選擇和樣本例數(shù)

2.1受試者選擇：臨床試驗(yàn)受試者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品聲稱(chēng)的適用人群進(jìn)行選擇，應(yīng)包含各種突變型樣本，以及各種可能的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本（其它病原體陽(yáng)性）等。

2.2樣本例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本臨床試驗(yàn)可依據(jù)試驗(yàn)用體外診斷試劑相對(duì)于對(duì)比試劑的陰、陽(yáng)性符合率或相對(duì)于臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和特異度分別估算最低陰、陽(yáng)性樣本例數(shù)。

2.2.1耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算

對(duì)于耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)，臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計(jì)算，

公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗(yàn)用體外診斷試劑評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

以已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑的比較研究中，陰陽(yáng)性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于95%，若以Sanger測(cè)序法作為對(duì)比方法，臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）可適當(dāng)降低。應(yīng)證明產(chǎn)品與對(duì)比試劑/方法的陰陽(yáng)性符合率（可信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

如申報(bào)產(chǎn)品為多突變位點(diǎn)檢測(cè)試劑，則其中常見(jiàn)的突變位點(diǎn)陽(yáng)性樣本例數(shù)應(yīng)分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，罕見(jiàn)的突變位點(diǎn)應(yīng)有一定的陽(yáng)性樣本例數(shù)，保證臨床性能得到充分的確認(rèn)。

2.2.2新基因突變位點(diǎn)與抗病毒藥物敏感性的相關(guān)性評(píng)價(jià)的樣本量估算

樣本量的估算可采用如下抽樣調(diào)查的公式計(jì)算：

公式中n為樣本量，Z1-α/2為置信度標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)，P為評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值，Δ為P的允許誤差大小。應(yīng)注意，P和Δ的取值應(yīng)有充分依據(jù)，其中Δ的常用取值為0.05，但當(dāng)預(yù)期值更高時(shí)應(yīng)考慮更優(yōu)的精度。

2.2.3臨床試驗(yàn)總體樣本量確定時(shí)應(yīng)在上述陰、陽(yáng)性樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況以及可能需要納入的干擾樣本、交叉反應(yīng)樣本等情況適當(dāng)增加入組樣本量。

此類(lèi)產(chǎn)品的檢測(cè)樣本類(lèi)型一般為血清或血漿，如果樣本類(lèi)型同時(shí)包括血清和血漿，且臨床前研究證明兩種樣本類(lèi)型檢測(cè)一致性較好，則臨床試驗(yàn)可以其中一種樣本類(lèi)型為主完成如上臨床試驗(yàn)，同時(shí)另一種樣本類(lèi)型采用一定數(shù)量樣本進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)（同源樣本對(duì)比或同類(lèi)產(chǎn)品對(duì)比）驗(yàn)證即可，其中應(yīng)包括一定數(shù)量的陽(yáng)性和陰性樣本，陽(yáng)性樣本中盡量包含預(yù)期適用的所有突變位點(diǎn)。

3.臨床研究單位的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開(kāi)展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇應(yīng)充分考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途，綜合流行病學(xué)背景，使臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者的選擇具有一定的地域代表性。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉臨床試驗(yàn)方案。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于試驗(yàn)用體外診斷試劑與對(duì)比試劑（方法）/參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑/方法的檢測(cè)/診斷結(jié)果，評(píng)價(jià)指標(biāo)一般包括臨床靈敏度、臨床特異度、陽(yáng)性符合率和陰性符合率等。

對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品，每種突變類(lèi)型均應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)于不一致樣本，應(yīng)進(jìn)行可能的原因分析，如臨床試驗(yàn)方案規(guī)定采用其他方法進(jìn)行確認(rèn)，則確認(rèn)結(jié)果不應(yīng)納入統(tǒng)計(jì)分析。

5.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請(qǐng)倫理委員會(huì)審查，并獲得倫理委員會(huì)的同意。注冊(cè)申報(bào)時(shí)應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見(jiàn)。

6.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)執(zhí)行統(tǒng)一的臨床試驗(yàn)方案，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

7.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開(kāi)始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

8.臨床試驗(yàn)報(bào)告撰寫(xiě)

臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫(xiě)參考《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、前期性能評(píng)估等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。

該試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽(yáng)性參考品符合率、精密度、最低檢測(cè)限等。性能指標(biāo)應(yīng)依據(jù)分析性能評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果確定，檢驗(yàn)方法應(yīng)明確具體操作方法和使用的樣本及參考品情況。

該產(chǎn)品為第三類(lèi)體外診斷試劑，申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫(xiě)規(guī)范的要求。

（十）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求，在符合《辦法》要求的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)，提供檢驗(yàn)合格報(bào)告。

（十一）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)的基因突變檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說(shuō)明書(shū)編制。

1.【預(yù)期用途】

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自乙型肝炎病毒核酸陽(yáng)性患者的血清/血漿樣本中的×××（具體的突變型）耐藥突變。本產(chǎn)品用于對(duì)×××藥物耐藥的輔助診斷。

1.2適用人群：應(yīng)為核苷（酸）類(lèi)似物治療過(guò)程中出現(xiàn)病毒學(xué)突破的乙型肝炎患者，除非有明確證據(jù)表明初治患者感染乙肝病毒來(lái)自于接受核苷（酸）類(lèi)似物抗病毒治療患者。一般不主張對(duì)初治患者進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)。

1.3簡(jiǎn)要介紹乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)的特征，包括突變位點(diǎn)的描述，所檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)與相應(yīng)藥物的相關(guān)性。

1.4強(qiáng)調(diào)該試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)患者治療進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

詳細(xì)說(shuō)明試劑盒檢測(cè)技術(shù)原理，包括核酸分離/純化方法、原理。說(shuō)明檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)信息；介紹引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)體系（管）組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

詳細(xì)說(shuō)明試劑盒內(nèi)各組分的名稱(chēng)、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應(yīng)說(shuō)明其生物學(xué)來(lái)源、活性及其他特性；說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)、貨號(hào)以及醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)/備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。當(dāng)試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時(shí)，應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后可以配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)與相應(yīng)的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。注明“生產(chǎn)日期及有效期至（或失效日期）見(jiàn)標(biāo)簽?！?

5.【適用儀器】

明確所有適用的儀器型號(hào)，提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶(hù)操作。

6.【樣本要求】

明確適用的樣本類(lèi)型，并詳細(xì)描述樣本采集及預(yù)處理要求、運(yùn)輸要求、保存條件及期限等。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)。質(zhì)控品參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項(xiàng)等。

7.4 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測(cè)基因、內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說(shuō)明質(zhì)控品的檢測(cè)要求。

8.【陽(yáng)性判斷值】

簡(jiǎn)要總結(jié)陽(yáng)性判斷值研究方法及結(jié)論。明確說(shuō)明樣本的陽(yáng)性判斷值。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

說(shuō)明質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的正確結(jié)果要求，結(jié)合質(zhì)控品以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)以陽(yáng)性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

應(yīng)至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨(dú)作為患者管理的依據(jù)。

10.2本產(chǎn)品僅檢測(cè)靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機(jī)制引起的耐藥本產(chǎn)品不能檢出。

10.3不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

10.4未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述分析性能評(píng)估的試驗(yàn)結(jié)果并簡(jiǎn)要描述臨床試驗(yàn)的基本信息、試驗(yàn)方法和結(jié)論。

12.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出生物安全性的警告。

12.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品性能僅針對(duì)聲稱(chēng)的適用樣本類(lèi)型及【樣本要求】項(xiàng)下說(shuō)明的樣本采集和處理方法進(jìn)行了驗(yàn)證，其他樣本類(lèi)型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

12.4強(qiáng)調(diào)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護(hù)程序。

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四、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。