結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2015年第65號(hào)）

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結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌和非洲分枝桿菌等引起的慢性傳染性疾病，可累及全身各個(gè)器官，以肺結(jié)核最為多見(jiàn)。其中，結(jié)核病的病原菌主要是結(jié)核分枝桿菌，牛結(jié)核分枝桿菌次之。結(jié)核分枝桿菌主要是經(jīng)空氣傳播，大多數(shù)人在感染結(jié)核分枝桿菌后并無(wú)癥狀，稱為潛伏感染。潛伏感染可持續(xù)幾十年，僅有5%—10%的潛伏感染者發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。

在結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，通常將分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex）和非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria, NTM）。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）、牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）。在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)各種中，除田鼠分枝桿菌對(duì)人無(wú)致病力外，其他三種菌均可對(duì)人致病，產(chǎn)生大致相同的臨床表現(xiàn)。因此，臨床上往往只做結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定而不進(jìn)行亞種水平的鑒定，用于結(jié)核輔助診斷的核酸檢測(cè)試劑也常采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的核酸序列作為靶標(biāo)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

核酸檢測(cè)是肺結(jié)核病原學(xué)診斷的重要參考。2009年，美國(guó)疾病控制預(yù)防中心（CDC）更新了肺結(jié)核的診療指南，將核酸檢測(cè)作為肺結(jié)核的輔助診斷方法，明確：對(duì)所有疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)至少進(jìn)行一個(gè)呼吸道樣本的核酸檢測(cè)。我國(guó)《臨床診療指南—結(jié)核病分冊(cè)》也明確：結(jié)核分枝桿菌的DNA檢測(cè)可作為肺結(jié)核診斷的參考。與其他實(shí)驗(yàn)室檢查方法比較，核酸檢測(cè)的價(jià)值在于：（1）可快速鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與非結(jié)核分枝桿菌，提高涂片陽(yáng)性肺結(jié)核的診斷特異性；（2）與涂片比較，靈敏度較高，可提高涂片陰性肺結(jié)核的檢出率；（3）與培養(yǎng)相比，操作快速，可及早進(jìn)行正確的醫(yī)療處置。

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑是指：利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，以特定的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的核酸序列為檢測(cè)靶標(biāo)，對(duì)痰、支氣管肺泡灌洗液中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑，用于肺結(jié)核的輔助診斷。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對(duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的靶核酸序列作為靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，對(duì)于某些以結(jié)核分枝桿菌特有的靶核酸序列為靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于預(yù)期用途為肺結(jié)核輔助診斷的、以痰或支氣管肺泡灌洗液作為適用樣本類型的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑。對(duì)于用途相同的其他呼吸道樣本類型，或者預(yù)期用途為肺外結(jié)核輔助診斷的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、最低檢測(cè)限及被測(cè)靶核酸序列的特性等方面寫明申報(bào)試劑與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若被測(cè)物為新的靶核酸序列，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測(cè)靶標(biāo)的核酸序列的臨床意義，即其與臨床應(yīng)用（可用于肺結(jié)核輔助診斷）的相關(guān)性，并提供充分的支持資料。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、酶、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及企業(yè)參考品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料購(gòu)自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

申請(qǐng)人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)制備過(guò)程，包括組成、來(lái)源、菌株特性（如名稱、種屬、靶核酸的拷貝數(shù)、濃度等）等信息。企業(yè)參考品的項(xiàng)目應(yīng)包括：陰性參考品、陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品、重復(fù)性參考品等。陽(yáng)性參考品應(yīng)著重考慮結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的代表菌株，陰性參考品則主要涉及對(duì)分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證情況。建議采用滅活的菌株建立企業(yè)參考品，不宜采用質(zhì)粒、菌株的基因組提取/純化物等核酸或臨床樣本（如痰液）。

申報(bào)試劑的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性、陰性、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）等各種對(duì)照來(lái)實(shí)現(xiàn)，需考慮對(duì)樣本核酸提取/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)量控制。陽(yáng)性對(duì)照的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測(cè)樣本的核酸性質(zhì)一致，如同為RNA或DNA。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種對(duì)照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。申報(bào)資料應(yīng)詳細(xì)描述對(duì)照的原料選擇、制備、定值過(guò)程等試驗(yàn)資料。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對(duì)于采用該方法學(xué)的結(jié)核核酸檢測(cè)試劑，建議至少設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)對(duì)照。

1.內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能存在的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、儀器、試劑和操作等所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。內(nèi)對(duì)照可采用不含靶核酸序列的質(zhì)?；蚓€性DNA、非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的病原體或克隆菌株，靶核酸為RNA時(shí)可采用假病毒等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶核酸序列檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

2.陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。陽(yáng)性對(duì)照可為：含有靶核酸序列的核酸、含有靶核酸序列的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物菌株或其他克隆菌株，靶核酸為RNA時(shí)可采用假病毒等。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種陽(yáng)性對(duì)照的Ct值或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確的范圍要求。

3.陰性對(duì)照

陰性對(duì)照對(duì)可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽(yáng)性結(jié)果的質(zhì)控。陰性對(duì)照可以是空白對(duì)照。陰性對(duì)照需參與樣本核酸的平行提取/純化。

由于申報(bào)試劑所適用的臨床樣本比較復(fù)雜，其中可能含有各種影響PCR反應(yīng)的抑制物，從而影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果，造成假陰性的可能性。因此，申報(bào)試劑應(yīng)充分考慮對(duì)樣本核酸提取/純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過(guò)設(shè)置各種對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。比如，采用克隆菌株作為內(nèi)對(duì)照，或者采用菌株作為陽(yáng)性對(duì)照并參與樣本核酸的平行提取/純化，或者設(shè)置專門的核酸提取/純化對(duì)照（如菌株）等，以對(duì)樣本核酸提取/純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評(píng)估。

4.核酸提取/純化組分（如適用）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

5.PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶、內(nèi)標(biāo)及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

5.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對(duì)純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

5.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到高效液相色譜純。如為外購(gòu)，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。

5.4 PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對(duì)酶活性有合理驗(yàn)證；應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。

6.核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（Dnase）或核糖核酸酶（Rnase）污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。
　　3.基因序列的選擇、PCR方法學(xué)特性介紹。

4.核酸提取/純化方法確定的研究資料。

5.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度、樣本量及反應(yīng)體積等。
　　6.確定PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。
　　7.對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

（四）分析性能評(píng)估資料

企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對(duì)申報(bào)試劑進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體的試驗(yàn)方法（操作步驟）、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸定性檢測(cè)試劑，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。

1.最低檢測(cè)限（分析靈敏度）

1.1最低檢測(cè)限的確定

建議使用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或BCG標(biāo)準(zhǔn)菌株（如適用）的梯度稀釋液來(lái)確定最低檢測(cè)限。每個(gè)梯度進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，將具有95%陽(yáng)性檢出率的菌株濃度作為最低檢測(cè)限。應(yīng)明確每份菌株的來(lái)源、基因型特性、濃度、制備方法等信息。企業(yè)可采用鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國(guó)家參考品對(duì)菌株濃度進(jìn)行標(biāo)定，以“個(gè)菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。

為確定痰樣本的最低檢測(cè)限，建議將已知濃度的菌株與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的痰樣本進(jìn)行混合，完全按照申報(bào)試劑的操作步驟對(duì)此“制備痰液”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取/純化、擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。最低檢測(cè)限的濃度應(yīng)是“制備痰液”的最終菌株濃度。

1.2最低檢測(cè)限的驗(yàn)證

應(yīng)在最低檢測(cè)限的菌株濃度對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株（如適用）進(jìn)行至少20次的重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，每種菌株的陽(yáng)性檢出率為95%。企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測(cè)限驗(yàn)證的各個(gè)菌株的來(lái)源、制備方法及濃度等信息?！白畹蜋z測(cè)限的驗(yàn)證”的試驗(yàn)方法可參考“最低檢測(cè)限的確定”。

2.分析特異性

2.1交叉反應(yīng)

用于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。主要包括：非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（NTM）、常見(jiàn)的口腔和呼吸道共生的病原體等，具體目錄參見(jiàn)表1和表2。

建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。建議進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的分枝桿菌、細(xì)菌或者真菌的最低濃度為106 CFU/mL；進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒的最低濃度為105 PFU/mL（plaque forming unit，PFU，空斑形成單位）。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體的制備方法、來(lái)源、種屬和濃度等信息。

對(duì)于某些難以培養(yǎng)或者因?yàn)樯锇踩詿o(wú)法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體核酸的來(lái)源、組成和濃度等信息。采用病原體核酸樣本進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)將核酸樣本視為實(shí)際使用過(guò)程中參與PCR反應(yīng)的核酸樣本，根據(jù)試劑說(shuō)明書的要求配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增。

有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說(shuō)明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中體現(xiàn)。

表1  用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌

（非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的其他分枝桿菌）

注：表中所列細(xì)菌均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2  用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體

注：表中所列病原體均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（如血液、粘液、人細(xì)胞等）和外源性藥物。

建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證，另外，建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于常見(jiàn)藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。

表3  用于干擾研究的外源性藥物

注：表中所列外源性藥物均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，括號(hào)內(nèi)至少選做一種。

3.精密度

測(cè)量精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)或國(guó)外的相關(guān)文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)申報(bào)試劑的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。

3.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)試劑（包括提取/純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)不同的適用機(jī)型（如PCR分析儀）、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

3.2合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少12天的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.3建議采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（“3.3.1陰性樣本”不適用）作為樣本，在以下3個(gè)濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證：

3.3.1陰性樣本：不含結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的樣本，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。
　  3.3.2弱陽(yáng)性樣本：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度略高于試劑盒的最低檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

3.3.3中等陽(yáng)性樣本：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度約為最低檢測(cè)限的2倍或3倍，陽(yáng)性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。

4.反應(yīng)性（包容性）

應(yīng)證明申報(bào)試劑可以檢測(cè)代表不同基因多態(tài)性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株。應(yīng)至少對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株(如適用)、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)采用略高于最低檢測(cè)限濃度的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株進(jìn)行研究。應(yīng)提供各個(gè)菌株的來(lái)源、菌株特性及濃度等信息。應(yīng)證明所有采用的菌株含有靶核酸序列。

5.不同樣本類型、樣本前處理方法、核酸提取/純化方法的分析性能資料要求

由于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間差異較大，如申報(bào)試劑同時(shí)包括這兩種樣本類型，申請(qǐng)人應(yīng)提交每種樣本類型的全項(xiàng)目分析性能評(píng)估資料。

對(duì)于每種樣本類型而言，申請(qǐng)人應(yīng)提交適用的樣本前處理方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測(cè)限項(xiàng)目），以證明不同的樣本前處理方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

對(duì)于每種樣本類型而言，申請(qǐng)人應(yīng)提供適用的核酸提取/純化方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的核酸提取/純化方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測(cè)限和精密性項(xiàng)目），以證明不同的核酸提取/純化方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

如果申報(bào)試劑同時(shí)適用于幾種不同的臨床樣本類型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類型應(yīng)明確其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果申報(bào)試劑最終僅保留某種樣本類型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，分析性能評(píng)估資料應(yīng)采用該組合進(jìn)行。

6.注意事項(xiàng)

對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說(shuō)明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的至少三批全性能評(píng)估資料。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

對(duì)于此類試劑，陽(yáng)性判斷值確定資料主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報(bào)試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文件。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)上下限確定的詳細(xì)的研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料
　  穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇3—5個(gè)溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析性能驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。用于樣本穩(wěn)定性研究的樣本應(yīng)包括最低檢測(cè)限濃度的樣本。除了定性結(jié)果之外，還需要提供原始信號(hào)的分析，如Ct。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn)

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照有關(guān)規(guī)定開(kāi)展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局資質(zhì)認(rèn)可。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景、病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須具有與申報(bào)試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備，并能夠確保該項(xiàng)試驗(yàn)的實(shí)施。

2.臨床試驗(yàn)樣本的選擇和樣本量

臨床試驗(yàn)對(duì)象的選擇應(yīng)滿足如下條件：（1）具有肺結(jié)核癥狀/體征的疑似肺結(jié)核患者病例，不建議選擇正常健康人群；（2）最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于350例，并且涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例應(yīng)不小于50%；（3）應(yīng)包括其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核），以對(duì)申報(bào)試劑的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，此部分病例不少于150例；（4）每個(gè)臨床試驗(yàn)對(duì)象的臨床樣本應(yīng)足量，以便同時(shí)進(jìn)行申報(bào)試劑、對(duì)比試劑和其他合理方法的檢測(cè)。

鑒于痰和支氣管肺泡灌洗液樣本之間的差異較大，如果申報(bào)試劑同時(shí)適用于兩種樣本類型，每種樣本類型的例數(shù)不少于500例。

臨床試驗(yàn)應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用凍存樣本應(yīng)另行說(shuō)明。

如果某種樣本類型適用于多種樣本前處理方法，應(yīng)進(jìn)行不少于150例同源樣本的對(duì)比試驗(yàn)，證明不同的樣本前處理方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。其中，最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于100例，涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核）不少于50例。

如果某種樣本類型適用于多種核酸提取/純化方法，應(yīng)進(jìn)行不少于150例同源樣本的對(duì)比試驗(yàn)，證明不同的核酸提取/純化方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。其中，最終臨床診斷為肺結(jié)核患者的病例不少于100例，涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不小于50%，其他易混淆疾病的病例（最終臨床診斷確定不是肺結(jié)核）不少于50例。

3.對(duì)比試劑的選擇

3.1對(duì)于“已有同品種批準(zhǔn)上市”試劑的臨床試驗(yàn)，申請(qǐng)人可按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用申報(bào)試劑與對(duì)比試劑進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。同時(shí)，申請(qǐng)人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的臨床樣本進(jìn)行申報(bào)試劑與培養(yǎng)鑒定方法的對(duì)比研究，每種樣本類型不少于100例，其中涂片陰性和陽(yáng)性各至少50例。培養(yǎng)方法可采用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)方法或臨床普遍認(rèn)可的液體培養(yǎng)方法，菌種鑒定方法可采用對(duì)硝基苯甲酸（p-methylbenzylsulfonyl，PNB）、測(cè)序、高性能的液相層析、質(zhì)譜、或其他已上市的核酸檢測(cè)試劑盒方法。臨床研究報(bào)告應(yīng)對(duì)采用的培養(yǎng)鑒定方法做詳細(xì)介紹。

3.2對(duì)于無(wú)法選擇對(duì)比試劑的新結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑，其臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇培養(yǎng)鑒定和/或核酸序列測(cè)定（測(cè)序）方法作為對(duì)比方法，總例數(shù)不少于500例。

3.2.1 有關(guān)培養(yǎng)鑒定方法的要求同3.1。

3.2.2 臨床研究報(bào)告應(yīng)對(duì)選用的測(cè)序方法做詳細(xì)介紹。申請(qǐng)人應(yīng)提供以下關(guān)于測(cè)序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，需由臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽章確認(rèn)。

3.2.2.1測(cè)序方法原理、測(cè)序儀型號(hào)、測(cè)序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

3.2.2.2測(cè)序方法所用引物相關(guān)信息，如核酸序列選擇、分子量、純度、功能性實(shí)驗(yàn)等資料。引物設(shè)計(jì)應(yīng)合理涵蓋申報(bào)試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段。

3.2.2.3 對(duì)所選測(cè)序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測(cè)限的確認(rèn)，建議將所選測(cè)序方法與申報(bào)試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析。

3.2.2.4 測(cè)序方法應(yīng)建立合理的陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品，以對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2.2.5 提交有代表性的樣本測(cè)序圖譜及結(jié)果分析資料。

如果申報(bào)試劑同時(shí)適用于幾種不同的臨床樣本類型、樣本前處理方法和核酸提取/純化方法，每種樣本類型應(yīng)明確規(guī)定其適用的樣本前處理方法（一種或幾種）和核酸提取/純化方法（一種或幾種）。如果申報(bào)試劑最終僅保留某種樣本類型、某種樣本前處理方法和某種核酸提取/純化方法，臨床試驗(yàn)應(yīng)采用該組合進(jìn)行。

4.臨床試驗(yàn)方法、臨床數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或者臨床試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)描述申報(bào)試劑和對(duì)比試劑的具體操作步驟。應(yīng)明確每個(gè)試驗(yàn)陰陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)，特別應(yīng)明確何為培養(yǎng)鑒定的陰陽(yáng)性。

4.2在臨床報(bào)告中，以列表的方式，明確：總樣本例數(shù)、臨床診斷為肺結(jié)核的患者總例數(shù)、涂片陰性的肺結(jié)核患者例數(shù)、涂片陽(yáng)性的肺結(jié)核患者例數(shù)、非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者與易混淆疾病樣本例數(shù)，以判斷病例選擇的科學(xué)合理性。

4.3臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括每個(gè)樣本的涂片結(jié)果、臨床診斷結(jié)果、申報(bào)試劑的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果。

4.4對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè)結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽(yáng)性符合率等。

4.5申報(bào)試劑對(duì)涂片陰性的肺結(jié)核患者應(yīng)有一定的檢出率；申報(bào)試劑對(duì)涂片陽(yáng)性肺結(jié)核患者的檢出率至少為90%；申報(bào)試劑的臨床特異性至少為90%。

4.6臨床試驗(yàn)中的某些樣本，采用申報(bào)試劑檢測(cè)時(shí)為陽(yáng)性，采用培養(yǎng)鑒定方法檢測(cè)時(shí)為陰性，出現(xiàn)這種情況的原因有：樣本前處理導(dǎo)致結(jié)核菌的培養(yǎng)受抑制；樣本中結(jié)核菌的濃度過(guò)低。這可能導(dǎo)致申報(bào)試劑的特異性低。因此，在進(jìn)行4.4統(tǒng)計(jì)分析的同時(shí)，建議進(jìn)行申報(bào)試劑與最終臨床診斷的對(duì)比統(tǒng)計(jì)分析，以客觀地反應(yīng)申報(bào)試劑的臨床特異性。

對(duì)于申報(bào)試劑與對(duì)比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┑牡刃栽u(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)申報(bào)試劑與對(duì)比試劑（或?qū)Ρ确椒ǎ┦欠竦刃У臉?biāo)準(zhǔn)。

5.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)或其他合理方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明理由。

6.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)試劑的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑對(duì)樣本類型的檢測(cè)要求。

7.臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床試驗(yàn)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

7.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述

7.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。

7.1.2病例的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存；痰液的培養(yǎng)、鑒定方法；培養(yǎng)鑒定陰性、陽(yáng)性的具體涵義等。

7.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

7.2具體臨床試驗(yàn)情況

7.2.1申報(bào)試劑和對(duì)比試劑的名稱、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息。

7.2.2對(duì)各試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)等情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

7.2.3質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對(duì)檢測(cè)精密度、質(zhì)控品測(cè)量值的抽查結(jié)果評(píng)估。

7.2.4具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本的保存條件、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。

7.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

7.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測(cè)或其他合理方法的復(fù)核以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對(duì)方案的修改。

7.3.2陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

7.3.3以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

7.4討論和結(jié)論

對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床試驗(yàn)有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求及說(shuō)明》的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。

產(chǎn)品技術(shù)要求中的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)與說(shuō)明書中相關(guān)內(nèi)容保持一致。如申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

（九）注冊(cè)檢驗(yàn)

根據(jù)《辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。如申報(bào)試劑有適用的國(guó)家參考品，應(yīng)采用國(guó)家參考品進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)，并符合國(guó)家參考品的相關(guān)要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書

產(chǎn)品說(shuō)明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說(shuō)明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地編制說(shuō)明書。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1試劑盒用于體外定性檢測(cè)人xx樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸。

1.2簡(jiǎn)單介紹結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括哪些種的細(xì)菌、致病性、感染后的臨床表現(xiàn)，靶核酸序列的特征（名稱和基因位置等）及選擇依據(jù)，其他病原體（如：非結(jié)核分枝桿菌NTM）中是否存在靶核酸序列。

1.3待測(cè)人群特征介紹：具有肺結(jié)核相關(guān)體征/癥狀和X線檢查結(jié)果的疑似結(jié)核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。

1.4強(qiáng)調(diào)：實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)接受過(guò)基因擴(kuò)增或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作資格，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備相應(yīng)的生物安全防護(hù)條件。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號(hào)及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取/純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸提取/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號(hào)、醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)等詳細(xì)信息。

3.【檢驗(yàn)原理】

3.1對(duì)試劑盒檢測(cè)的靶核酸序列進(jìn)行詳細(xì)描述（名稱和基因位置等），對(duì)不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。

3.2核酸提取/純化方法、原理等。

3.3試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開(kāi)封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期。

5.【樣本要求】重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：

5.1樣本的收集：應(yīng)參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項(xiàng)。

5.2臨床樣本的前處理（如適用）：應(yīng)參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法，尤其是痰標(biāo)本，如堿處理-直接法、N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）-NaOH法等，詳細(xì)描述具體的前處理方法。

5.3樣本的其他處理、運(yùn)送和保存：明確核酸提取/純化前的其他處理（如離心、洗滌等）、保存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）、運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制。

6.【適用儀器】所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

7.3詳述待測(cè)樣本及相關(guān)對(duì)照核酸提取/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用）。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

7.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）、核酸提取/純化對(duì)照（如適用）以及樣本管檢測(cè)結(jié)果的Ct值，以列表的形式對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理、樣本中細(xì)菌含量過(guò)低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.2待測(cè)靶核酸的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.3未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

9.3有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析

除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群外，其他病原體可能含有靶核酸序列，因而導(dǎo)致假陽(yáng)性，列出可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的病原體目錄。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

10.1對(duì)國(guó)家參考品檢測(cè)的符合情況，簡(jiǎn)要描述采用國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果（如適用）。

10.2最低檢測(cè)限：說(shuō)明試劑的最低檢出濃度，簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的試驗(yàn)方法及結(jié)果。

10.3企業(yè)陽(yáng)性、陰性參考品的檢測(cè)符合情況，簡(jiǎn)單介紹陰陽(yáng)性參考品的組成、濃度和符合率結(jié)果等信息。

10.4精密度：精密度參考品的組成、濃度及結(jié)果。

10.5分析特異性

10.5.1交叉反應(yīng)：對(duì)出現(xiàn)在相應(yīng)臨床標(biāo)本中可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式明確經(jīng)過(guò)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱、菌株特性、濃度等信息；

10.5.2干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如血液、粘液或藥物等；

10.6對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

10.7境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)。

11【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1有關(guān)人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)xx組份可能含有人源物質(zhì)，雖已經(jīng)通過(guò)了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項(xiàng)目的檢測(cè)，但截至目前，沒(méi)有任何一項(xiàng)檢測(cè)可以確保絕對(duì)安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對(duì)待。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)，或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、名詞解釋

1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

2.熒光探針PCR

在PCR過(guò)程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

3.分析特異性 analytical specificity

測(cè)量程序只測(cè)量被測(cè)量物的能力。分析特異性用于描述檢測(cè)程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測(cè)量被測(cè)量物的能力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來(lái)描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。

4.精密度 precision

在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測(cè)量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

5.最低檢測(cè)限 detection limit, limit of detection

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測(cè)量的最低值。

6.閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以擴(kuò)增過(guò)程前3到15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

7.內(nèi)標(biāo) internal control

在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。