腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2014年第2號）

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腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

本指導(dǎo)原則所述腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑是指利用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法的核酸檢測技術(shù)，以腫瘤個體化治療相關(guān)的突變基因?yàn)闄z測目標(biāo)，對人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組分中的目標(biāo)序列進(jìn)行體外檢測的試劑。

本指導(dǎo)原則所指基因突變的類型包括置換、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常及核糖核酸（RNA）表達(dá)異常等廣義的基因突變。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對于高分辨熔解曲線PCR方法、Luminex平臺或核酸檢測芯片等其他基于PCR的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)實(shí)際產(chǎn)品特性選擇適合的方法或補(bǔ)充需要的評價和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證其科學(xué)合理性，同時確認(rèn)性能評價的充分性。本指導(dǎo)原則所涉及試劑的方法學(xué)不包括熒光原位雜交（Fluorescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH）、核酸序列測定、染色體核型分析及免疫組化技術(shù)等用于腫瘤個體化治療指導(dǎo)的其他方法學(xué)。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無同品種批準(zhǔn)上市，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測靶標(biāo)的突變基因與個體化治療方案的相關(guān)性，說明理論依據(jù)。

提交的資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實(shí)驗(yàn)方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。需要強(qiáng)調(diào)的是，產(chǎn)品說明書內(nèi)容應(yīng)與申請人前期完成的分析性能評估、穩(wěn)定性研究、臨床實(shí)驗(yàn)研究等技術(shù)資料完全一致。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤的組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇依據(jù)，靶基因及其表達(dá)蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到的作用，相關(guān)藥物或其他治療技術(shù)及其作用機(jī)理、與待測突變位點(diǎn)可能存在的關(guān)系等。

如申報試劑未與具體治療方案聯(lián)合進(jìn)行相應(yīng)的臨床試驗(yàn)研究，關(guān)于靶基因突變與腫瘤疾病及治療方案的相關(guān)性描述僅僅來自診療指南、書籍、文獻(xiàn)等資料，則在本項(xiàng)下應(yīng)注明參考資料的出處，預(yù)期用途的相關(guān)表述中不應(yīng)涉及具體藥物產(chǎn)品（商品）名稱、生產(chǎn)企業(yè)信息等，并注明未將該產(chǎn)品與具體藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床試驗(yàn)，僅針對靶基因突變的檢測性能進(jìn)行了驗(yàn)證；若已將試劑盒與具體藥品聯(lián)合進(jìn)行了相關(guān)臨床試驗(yàn)，并證明其具有指導(dǎo)治療的臨床意義，則可在此明確具體藥物，并在說明書中對相關(guān)的臨床研究情況進(jìn)行簡介。

1.2試劑盒用于特定腫瘤患者人群，通過檢測人體樣本提取的核酸組分中是否存在靶基因突變，對臨床上特定腫瘤患者的個體化治療提供參考意見。腫瘤的類別及適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實(shí)際的臨床研究完成情況進(jìn)行確認(rèn)。

1.3明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者靶基因序列的檢測，其檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點(diǎn)或突變類型進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關(guān)特征等），對引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。

2.2核酸分離/純化方法、原理等。

2.3試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說明。如添加了相關(guān)的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應(yīng)對其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成份】

3.1詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、內(nèi)容物、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對該項(xiàng)檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他必要的信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗(yàn)證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器械注冊證號（如有）等詳細(xì)信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】 

重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：

6.1對適用的樣本類型作詳細(xì)介紹，包括樣本來源及取材要求、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細(xì)胞比例等。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。

6.2樣本處理及保存：核酸分離/純化前樣本的預(yù)處理、保存條件及期限（短期、長期）、運(yùn)輸條件等。

6.3在核酸分離/純化過程結(jié)束后，應(yīng)采用適當(dāng)方法對分離/純化后的核酸儲備液進(jìn)行質(zhì)量控制。比如，采用分光光度計法對分離/純化后的核酸儲備液進(jìn)行濃度、純度檢測，并依據(jù)性能驗(yàn)證結(jié)果在此給出用于擴(kuò)增試驗(yàn)的核酸溶液濃度范圍要求。舉例：擴(kuò)增反應(yīng)終體系中需要50ng的脫氧核糖核酸（DNA）量，而在終體系中需加入25μL的DNA儲備液，則在DNA分離/純化完成后應(yīng)將DNA儲備液的濃度調(diào)整至2ng/μL的濃度。

如分離/純化后的核酸儲備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

6.4操作過程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA/RNA儲備液、反應(yīng)終體系等(常溫/冷藏/冷凍/凍融次數(shù)限制等）。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項(xiàng)。

7.2詳述核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)。對照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本核酸的平行提?。ㄈ缬斜匾詫怂岱蛛x/純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。

7.3擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項(xiàng)等。

7.4逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）的溫度和時間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.5儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)和對照品的熒光通道選擇等。

8.【參考值（參考范圍）】

參考值（參考范圍）的描述包括基線的確定方法和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）的要求（如適用）。除Ct值要求外，建議結(jié)合是否出現(xiàn)典型S形曲線對結(jié)果進(jìn)行判斷。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果（Ct值），對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】

10.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者個體化治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

10.2陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細(xì)胞過少、核酸過度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶基因濃度低于檢測限亦可造成陰性結(jié)果。

10.3腫瘤組織（細(xì)胞）可能存在較大異質(zhì)性，不同部位取樣可能會得到不同的檢測結(jié)果。

10.4不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理，以及不當(dāng)?shù)脑囼?yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。

10.5明確該檢測僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測系統(tǒng)（包括適用機(jī)型、核酸分離/純化試劑、檢測方法等）。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

11.1對相應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合情況。

11.2最低檢測限：說明在試劑盒規(guī)定的檢測條件及擴(kuò)增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃度，重點(diǎn)考慮原始模板中突變基因的百分率和擴(kuò)增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響；并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

11.3企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設(shè)置以及評價標(biāo)準(zhǔn)等信息。

11.4精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度要求及評價標(biāo)準(zhǔn)，不同濃度精密度參考品的檢測結(jié)果（變異系數(shù)）。

11.5分析特異性

11.5.1野生型驗(yàn)證：應(yīng)采用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果應(yīng)均為陰性。

11.5.2試劑盒內(nèi)交叉反應(yīng)：如考核試劑包括對多個突變位點(diǎn)的檢測，則應(yīng)對該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的所有突變類型間進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

11.5.3序列相近或具有一定同源性的其他較常見突變或野生型基因序列間的交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

11.5.4潛在干擾物質(zhì)驗(yàn)證。

如果經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果，則應(yīng)該對存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進(jìn)行驗(yàn)證并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的提示。

11.6對比試驗(yàn)研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

12.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明

擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項(xiàng)中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因的基因位點(diǎn)、引物/探針設(shè)計及來源、參考品設(shè)置、來源及驗(yàn)證情況、各種酶的來源、特性及驗(yàn)證等重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。

腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑的注冊檢測應(yīng)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽性對照品（質(zhì)控品）的Ct值要求（包括內(nèi)標(biāo)）、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒覆蓋范圍內(nèi)不同突變基因的檢測符合性，陰性參考品則重點(diǎn)對申報試劑的分析特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

如果申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家標(biāo)準(zhǔn)品的檢測項(xiàng)目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行,對于目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)品的項(xiàng)目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。

（五）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交工藝驗(yàn)證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

1. 核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

2. PCR和/或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。

2.2引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端(和/或3-端)進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光素進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。

3. 核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

4. 企業(yè)內(nèi)部參考品：應(yīng)詳細(xì)說明有關(guān)企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值過程等試驗(yàn)資料。具體要求如下：

4.1陽性參考品

試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽性參考品，每個突變位點(diǎn)設(shè)置至少三個突變百分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及濃度需經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。

如申報試劑用于DNA樣本的檢測，則陽性參考品可以采用臨床樣本提取的DNA儲備液、相應(yīng)質(zhì)?；蚣?xì)胞系（如有）作為原料。如申報試劑用于RNA樣本的檢測，陽性參考品可以采用臨床樣本提取的RNA儲備液、相應(yīng)RNA凍干粉或模擬缺陷病毒（假病毒）的形式；如覆蓋突變位點(diǎn)過多，可以對其中部分突變位點(diǎn)采用質(zhì)粒的形式，但不能全部采用質(zhì)粒，需包括部分突變類型（申請人自行確定其代表性）RNA為模板的陽性參考品以對逆轉(zhuǎn)錄（RT）過程進(jìn)行監(jiān)控。

4.2陰性參考品

可采用經(jīng)確認(rèn)無相應(yīng)靶突變序列的野生型DNA儲存液。

4.3檢測限參考品

檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型。在進(jìn)行最低檢測限性能評估時，應(yīng)設(shè)置多個梯度，主要從擴(kuò)增反應(yīng)終體系核酸濃度和突變序列所占百分率兩個方面進(jìn)行評價，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)設(shè)置檢測限參考品時，可以僅設(shè)置一個濃度水平，該水平可略高于95%的陽性檢出率水平，而設(shè)置為100%檢出，應(yīng)明確參考品中靶核酸濃度水平和突變百分率。

4.4精密度參考品

精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱陽性、中或強(qiáng)陽性水平的精密度驗(yàn)證，中/強(qiáng)陽性精密度參考品可不必包括所有突變類型，以常見突變類型（申請人自行確定其代表性）為主，但弱陽性參考品需包括所有突變位點(diǎn)；如有必要，建議同時設(shè)置陰性參考品精密度驗(yàn)證。

5. 試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒對照品來實(shí)現(xiàn)，質(zhì)控體系需考慮對樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。所有陽性對照品的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測樣本的靶核酸性質(zhì)一致，如同為DNA或RNA。對照品可采用質(zhì)粒、假病毒或臨床樣本的核酸提取液等進(jìn)行配置。申報資料應(yīng)對試劑盒對照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程等試驗(yàn)資料詳細(xì)說明。申請人應(yīng)視申報產(chǎn)品具體情況設(shè)置合理的試劑盒對照品（質(zhì)控品），試劑盒質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。

5.1陽性對照品（質(zhì)控品）

建議對每個樣品反應(yīng)管設(shè)置至少一份陽性對照品（質(zhì)控品），陽性對照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提?。ㄈ缬斜匾詫颖竞怂岱蛛x/純化、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)過程等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制，企業(yè)應(yīng)對各種陽性對照品（質(zhì)控品）的Ct值做出明確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢測（分型或不分型），相應(yīng)的陽性對照管可以不必涉及所有突變類型，但應(yīng)選擇較常見突變序列或理論上較難測得的突變序列作為陽性對照。

5.2內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）

內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達(dá)異常等檢測目的時，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當(dāng)?shù)钠渌蛐蛄凶鳛橄鄳?yīng)的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）。申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

5.3陰性對照

陰性對照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白對照，以對可能存在的交叉污染進(jìn)行假陽性結(jié)果的質(zhì)控。陰性對照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。

由于臨床標(biāo)本多為經(jīng)過復(fù)雜處理的病理切片或組織，其中核酸的完整性容易被破壞，從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成假陰性的可能性。因此，除上述對照品外，申報試劑的反應(yīng)體系中應(yīng)充分考慮對核酸分離/純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，比如，設(shè)置專門的質(zhì)控管對管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，以對核酸分離/純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評估。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。主要包括以下內(nèi)容：

1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2. 反應(yīng)原理介紹。

3. 基因位點(diǎn)選擇、(RT)-PCR方法學(xué)特性介紹。

4. 確定最佳(RT)-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5. 確定逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）的溫度和時間的研究資料，PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

6. 對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

7. 不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

8. 如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

（七）分析性能評估資料

企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。若試劑用于RNA樣本檢測，則在性能評估中（除非特別說明）需對所有突變位點(diǎn)均采用RNA樣本，從而對逆轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行驗(yàn)證。

建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1. 樣本核酸分離/純化

樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，并且樣本在不當(dāng)?shù)谋４鏃l件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分離/純化的難度。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸分離/純化的環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2. 陽性/陰性參考品符合率

各水平、各突變位點(diǎn)的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)置，在其相應(yīng)的引物探針組合下檢測應(yīng)為陽性。

3. 最低檢測限

建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限主要考慮以下兩種情形。

3.1在擴(kuò)增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，突變序列所占百分率的最低檢測限。

采用野生型臨床樣本和較高突變百分率的臨床樣本提取的核酸儲備液進(jìn)行混合，確定擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的核酸濃度，采用合理的試驗(yàn)方法（如深測序）對混合后樣本中突變序列所占百分率進(jìn)行確認(rèn)，并逐漸調(diào)整野生型和突變型核酸儲備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液。如上述方法不易實(shí)現(xiàn)，也可采用含相應(yīng)突變類型的質(zhì)粒與野生型基因組DNA（或野生型質(zhì)粒）混合的方法來制備相應(yīng)的混合液。對各份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。

舉例：在50ng/40μL水平，可以達(dá)到95%陽性檢出率的最低突變序列百分率為10%。

3.2在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃度的最低檢測限。

采用合理的實(shí)驗(yàn)方法確定待測樣本中的突變序列所占的百分率，或采用突變型質(zhì)粒與野生型基因組DNA（或野生型質(zhì)粒）按一定比例混合（如固定在10%的水平），再逐級稀釋成不同核酸濃度樣本，分別對各梯度濃度樣本進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率的最低DNA（RNA）濃度。

舉例：在10%的突變序列百分率水平，40μL擴(kuò)增反應(yīng)終體系中，DNA濃度的最低檢測限為50ng/40μL。

3.3建議評價腫瘤細(xì)胞比例、DNA（RNA）降解等因素對最低檢測限可能造成的影響。

4. 分析特異性

4.1野生型驗(yàn)證：采用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為陰性。

4.2交叉反應(yīng)，對于此類產(chǎn)品的交叉反應(yīng)驗(yàn)證主要考慮以下幾方面情形：

4.2.1申報試劑所覆蓋的全部突變類型間的交叉反應(yīng)；

4.2.2核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列間的交叉反應(yīng)。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來源、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

4.3干擾物質(zhì)

4.3.1申請人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質(zhì)。

4.3.2用于干擾試驗(yàn)的樣本，靶基因濃度應(yīng)至少包含弱陽性，而不應(yīng)僅選擇強(qiáng)陽性樣本，使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，建議申請人同時在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下同樣進(jìn)行評價。

有關(guān)干擾物質(zhì)的研究結(jié)果亦應(yīng)總結(jié)于產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)下。

5. 精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

5.1對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

5.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對室間精密度進(jìn)行評價。

5.3用于精密度評價的參考品應(yīng)至少包括弱陽性參考品和高濃度參考品2個水平，如有必要，建議同時設(shè)置陰性參考品進(jìn)行驗(yàn)證，要求如下:

5.3.1陰性參考品：待測靶核酸濃度低于最低檢測限或?yàn)榱銤舛?，建議選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。

5.3.2弱陽性參考品：待測靶核酸濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)達(dá)到100%（n≥20）。（弱陽性參考品需包括所有的突變位點(diǎn)，如果待測物靶核酸為RNA，則弱陽性精密度參考品中應(yīng)至少部分典型突變位點(diǎn)的原料為RNA，如RNA干粉或相應(yīng)的假病毒）

5.3.3高濃度參考品：待測靶核酸呈中到強(qiáng)陽性的濃度，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。（如果試劑盒可以覆蓋多個突變位點(diǎn)的檢測，該參考品可以設(shè)置為對全部突變位點(diǎn)進(jìn)行精密度驗(yàn)證，也可以選擇其中部分突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，但應(yīng)至少包含常見突變序列或理論上較難測得的突變序列）

6. 其他需注意問題

對于適用多個機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號儀器的性能評估資料。若試劑盒適用的樣本類型不止一種，如既包含石蠟包埋組織切片亦包含冷凍組織切片或血液樣本等，則需對所有樣本類型的適用性進(jìn)行評估，并提交評估資料。

（八）參考值（參考范圍）確定資料

對于此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括效期穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于效期穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

另外，樣本穩(wěn)定性的研究對于實(shí)驗(yàn)的成敗也至關(guān)重要。特別是當(dāng)使用標(biāo)本類型包括組織標(biāo)本時，腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)過特殊處理后其核酸序列的完整性容易遭到破壞，因此應(yīng)提供對樣本保存條件、保存時間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸分離/純化前樣本穩(wěn)定性和分離/純化后核酸在儲備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項(xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（十）臨床試驗(yàn)研究

對于國內(nèi)外尚無同類產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市或無充足資料證明其臨床預(yù)期用途的新型腫瘤相關(guān)基因突變，相關(guān)檢測試劑的臨床研究不能單純采用對比試驗(yàn)的方法，而應(yīng)將試劑盒臨床研究納入相關(guān)藥物的臨床研究或臨床應(yīng)用中，通過對特定的腫瘤病人進(jìn)行治療前后的跟蹤隨訪，以臨床對于患者個體化治療方案及有效性的綜合判斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評價此類試劑用于指導(dǎo)腫瘤個體化治療的臨床性能。其中，有關(guān)診斷試劑臨床研究的臨床試驗(yàn)資料應(yīng)符合《辦法》、《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）以及《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求。

對于已有同類產(chǎn)品上市的、基因突變類型與腫瘤個體化治療方案的相關(guān)性已經(jīng)得到確認(rèn)的產(chǎn)品，則申請人既可采用試劑盒檢測與相關(guān)藥物治療相結(jié)合對特定的腫瘤病人進(jìn)行治療前后的跟蹤臨床研究的方法，亦可在充分結(jié)合相關(guān)的病例信息的情況下，采用考核試劑與參比方法進(jìn)行對比試驗(yàn)的研究方法，對考核試劑的臨床應(yīng)用有效性進(jìn)行評價。

以下要求均針對采用對比試驗(yàn)方法的臨床研究提出。

1. 參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：

1.1如已有同類產(chǎn)品上市，其臨床研究可以選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。但應(yīng)充分考慮已上市同類試劑的突變位點(diǎn)選擇、靶序列選擇、最低檢測限等特性，確?？己嗽噭┡c申報試劑具有明確可比性。

1.2申請人亦可采用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的參比方法，驗(yàn)證考核試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定（測序）結(jié)果之間的一致性情況。臨床研究報告中應(yīng)對選用的測序方法作詳細(xì)介紹，并對委托測序服務(wù)的機(jī)構(gòu)（如涉及）資質(zhì)和選擇依據(jù)作簡要說明或提供相關(guān)資料。

申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，需有臨床試驗(yàn)單位或委托測序服務(wù)機(jī)構(gòu)的簽章確認(rèn)。

1.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

1.2.2測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實(shí)驗(yàn)等資料。引物設(shè)計應(yīng)合理涵蓋考核試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段、位點(diǎn)、及所有突變類型。

1.2.3對所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與申報試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對分析。

1.2.4測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

1.3此外，在充分考慮檢測結(jié)果具有明確可比性的前提下，也可以選擇熒光原位雜交（FISH）或免疫組化等染色體或蛋白水平的檢測技術(shù)作為參比方法，但考慮到檢測結(jié)果之間不具有直接的可比性，建議對所有陽性病例采用其他分子生物學(xué)技術(shù)（如核酸序列測定）對結(jié)果予以確認(rèn)。測序部分資料的提交參考上一條要求。

2. 臨床研究單位的選擇

建議申請人在選擇臨床單位時，應(yīng)在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究單位應(yīng)具有分子病理診斷和分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實(shí)驗(yàn)中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3. 臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應(yīng)完全一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。臨床方案中還應(yīng)明確復(fù)核試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測的基因突變類型不應(yīng)超越參比試劑的相應(yīng)檢測要求，若此種情況發(fā)生，則應(yīng)選擇其他合理參比方法對額外的樣本類型和基因突變類型進(jìn)行驗(yàn)證。

4. 病例選擇及陽性病例比例

臨床試驗(yàn)應(yīng)以腫瘤患者為研究對象，其中試劑盒規(guī)定范圍的每種突變類型均應(yīng)有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)驗(yàn)證的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰/陽性病例均應(yīng)覆蓋所有適用的腫瘤類型。若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應(yīng)對所有樣本類型均進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

5. 統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實(shí)驗(yàn)的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表χ2檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果有無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗(yàn)假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

6. 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7. 臨床試驗(yàn)總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

7.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計及方案描述

7.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

7.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

7.1.4統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

7.2具體的臨床試驗(yàn)情況

7.2.1臨床研究所用產(chǎn)品的名稱、批號、有效期及所用機(jī)型等信息，以及對比試驗(yàn)產(chǎn)品的注冊情況。

7.2.2對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進(jìn)行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

7.2.3質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

7.2.4具體試驗(yàn)過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。

7.3統(tǒng)計學(xué)分析

7.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗(yàn)證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

7.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率。

7.3.3以交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表χ2檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進(jìn)行綜合分析。

7.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗(yàn)結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

三、名詞解釋

1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

2. 雜交 hybridization

具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）可以通過氫鍵的方式，按堿基互補(bǔ)配對原則相結(jié)合。

3. 熒光探針PCR

在PCR過程中利用熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達(dá)到對原始模板量進(jìn)行分析的PCR。

4. 分析特異性 analytical specificity

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。（潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物）

5. 精密度 precision

在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

6. 檢測限 detection limit, limit of detection

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測測量的最低值。

7. 閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct

實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計算方式是以擴(kuò)增過程前3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。

8. 突變 mutation

是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的改變。

9. 內(nèi)標(biāo) internal control

在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。

四、參考文獻(xiàn)

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腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑
技術(shù)審查指導(dǎo)原則編制說明

一、背景信息

近年來，腫瘤的治療取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，然而，在腫瘤的治療中，無論是療效還是毒性反應(yīng)都存在較大的個體差異。即使是同一個部位的腫瘤，相同的治療方法對不同的個體也會導(dǎo)致不同的治療結(jié)果。如用于治療非小細(xì)胞型肺癌的藥物吉非替尼，絕大多數(shù)的非小細(xì)胞肺癌病人對吉非替尼無反應(yīng)，但約10%的病人對吉非替尼表現(xiàn)出快速且非常顯著的療效。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因18-21號外顯子序列發(fā)生突變后會使吉非替尼的療效更好。在臨床上通過檢測腫瘤患者，腫瘤組織中基因突變靶點(diǎn)及基因單核苷酸序列多態(tài)性（SNP）分型、基因重排、基因拷貝數(shù)異常、核糖體核糖核酸（mRNA）表達(dá)異常等為臨床提供個體化治療的依據(jù)，能顯著提高治療的效率，降低藥物的毒副作用。目前用于腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變的檢測還有：CYP2C19基因檢測、HER-2基因檢測、K-ras基因檢測等。進(jìn)行腫瘤個體化治療的基礎(chǔ)和前提是腫瘤分子靶標(biāo)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。多種原因會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，包括檢測試劑的方法學(xué)上的局限性，檢測試劑原材料的設(shè)計和選擇等，除此之外，樣本質(zhì)量對檢測結(jié)果也有影響，如：樣本中核酸的分離/純化過程、樣本中不可避免的一些干擾物質(zhì)等。假陽性的檢測結(jié)果不僅使患者的治療達(dá)不到預(yù)期的效果，還會使病人承受不必要的痛苦；而假陰性的檢測結(jié)果會給臨床醫(yī)生錯誤的用藥指導(dǎo)，使病人錯過最佳的治療時機(jī)，最終導(dǎo)致病人病情的惡化，甚至死亡。因此相關(guān)的生產(chǎn)企業(yè)必須充分意識到該類產(chǎn)品的潛在風(fēng)險，根據(jù)本指導(dǎo)原則的要求對該類試劑的安全性和有效性進(jìn)行科學(xué)合理的驗(yàn)證。

腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑是指利用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法的核酸檢測技術(shù)，以腫瘤個體化治療相關(guān)的突變基因?yàn)闄z測目標(biāo)，對人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組份中的目標(biāo)序列進(jìn)行體外檢測的試劑。

二、編制目的

目前，涉及腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測試劑研制及注冊申報的生產(chǎn)企業(yè)眾多，但不同廠家的產(chǎn)品在擴(kuò)增引物、熒光探針的設(shè)計及臨床驗(yàn)證等方面差異較大，分析性能明顯不一，雖然《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）、《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》、《體外診斷試劑臨床研究指導(dǎo)原則》等體外診斷試劑法規(guī)文件對該類試劑的注冊申報資料提出了原則性要求，但在技術(shù)審評環(huán)節(jié)中仍然遇到許多細(xì)節(jié)性技術(shù)問題有待統(tǒng)一。隨著技術(shù)審評工作的不斷積累，對該類產(chǎn)品的技術(shù)要求以及存在問題也逐漸明確，因此，有必要制定相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則對這些共性問題進(jìn)行總結(jié)規(guī)范。

本指導(dǎo)原則旨在讓申請人明確審評部門對本類試劑重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容、規(guī)范注冊申請人對注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫、解釋企業(yè)在注冊申報過程中對一些常見問題的疑惑、盡量減少技術(shù)審評環(huán)節(jié)的注冊資料補(bǔ)充，同時有利于規(guī)范技術(shù)審評要求，統(tǒng)一審評尺度。本文內(nèi)容不包括注冊審批的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行。企業(yè)在實(shí)際操作過程中可以采用其他合理方式，但應(yīng)有充分的證據(jù)說明其所用方法可以有力保證試劑的安全有效性。

三、重點(diǎn)技術(shù)問題的說明

（一）產(chǎn)品說明書中針對【預(yù)期用途】、【樣本要求】、【檢驗(yàn)方法】、【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】及【檢驗(yàn)方法的局限性】等項(xiàng)目增加了有關(guān)腫瘤個體化治療相關(guān)基因突變檢測的特殊說明。在【樣本要求】部分對本類試劑在檢測過程中所需樣本的特殊要求及對樣本處理過程的質(zhì)量控制進(jìn)行了明確，在【檢驗(yàn)方法的局限性】部分，專門對由于非試劑原因造成的假陽性或假陰性結(jié)果進(jìn)行了可能性的分析。

（二）主要原材料的研究資料中包含內(nèi)對照。

內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達(dá)異常等檢測目的時，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當(dāng)?shù)钠渌蛐蛄凶鳛橄鄳?yīng)的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）。申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。

（三）明確提出對樣本核酸分離純化的要求。

樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴(kuò)增過程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，并且樣本在不當(dāng)?shù)谋４鏃l件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分離/純化的難度。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸分離/純化的環(huán)節(jié)做充分的驗(yàn)證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

（四）分析特異性包括野生型驗(yàn)證和交叉反應(yīng)兩部分，前者為采用不同濃度的野生型核酸樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為陰性。后者主要包括以下兩個方面，其一，申報試劑所覆蓋的全部突變類型間的交叉反應(yīng)；其二，核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其他突變類型序列間的交叉反應(yīng)。申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的突變或野生型序列來源、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

（五）陽性/陰性參考品。

如申報產(chǎn)品有相應(yīng)的國家參考品，則企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品應(yīng)參考國家參考品的項(xiàng)目設(shè)置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結(jié)合實(shí)際情況設(shè)置合理的企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，應(yīng)著重考慮試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽性參考品，每個突變位點(diǎn)設(shè)置至少三個突變百分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及濃度需經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。

（六）臨床試驗(yàn)參比方法的選擇可以是境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，也可選擇核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的參比方法。此外，在充分考慮檢測結(jié)果具有明確可比性的前提下，也可以選擇熒光原位雜交（FISH）或免疫組化等染色體或蛋白水平的檢測技術(shù)作為參比方法，但考慮到檢測結(jié)果之間不具有直接的可比性，建議對所有陽性病例采用其他分子生物學(xué)技術(shù)（如核酸序列測定）對結(jié)果予以確認(rèn)。測序部分資料的提交參考上一條要求。

（七）病例選擇及陽性病例比例。臨床試驗(yàn)應(yīng)以腫瘤患者為研究對象，其中試劑盒規(guī)定范圍的每種突變類型均應(yīng)有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)驗(yàn)證的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰/陽性病例均應(yīng)覆蓋所有適用的腫瘤類型。若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應(yīng)對所有樣本類型均進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

四、編寫單位

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。