猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）（2022年第31號）

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國家藥監(jiān)局器審中心關(guān)于發(fā)布猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）的通告（2022年第31號）

發(fā)布時間：2022-07-15

　　為規(guī)范猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評工作，國家藥監(jiān)局器審中心組織編寫了《猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）》，現(xiàn)予發(fā)布。

　　特此通告。

　　附件：猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）

國家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術(shù)審評中心
2022年7月15日

　　附件

猴痘病毒核酸檢測試劑技術(shù)審評要點（試行）

　　本審評要點旨在指導(dǎo)注冊申請人對猴痘病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

　　本審評要點是對猴痘病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

　　一、適用范圍

　　本審評要點適用于猴痘病毒核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號）等相關(guān)法規(guī)要求。

　　二、注冊審查要點

　?。ㄒ唬┍O(jiān)管信息

　　1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

　　產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令第48號）及相關(guān)法規(guī)的要求，如猴痘病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

　　2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

　　（二）綜述資料

　　綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機(jī)型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提取（手工和自動提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因區(qū)域，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

　?。ㄈ┊a(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

　　注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（2022年第8號）的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

　　猴痘病毒核酸檢測試劑如有國家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國家標(biāo)準(zhǔn)品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗。

　　猴痘病毒核酸檢測試劑的檢出限水平應(yīng)符合國家相關(guān)指南文件規(guī)定申報產(chǎn)品對國家靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果應(yīng)與聲稱的檢出限水平相當(dāng)。

　　如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

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　　注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。

　　如申報產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗證。

　　分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。如果樣本的陰陽性或濃度值由其他單位提供，需要由該單位出具蓋章的樣本信息文件。

　　分析性能評估中如使用稀釋樣本，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。

　　分析性能評估用樣本應(yīng)當(dāng)為真實樣本，可采用境內(nèi)或境外樣本進(jìn)行研究。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

　　建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

　　1.反應(yīng)體系

　　1.1樣本采集和處理

　　根據(jù)適用樣本類型，進(jìn)行樣本采集研究。提供樣本采集器具和保存液等的詳細(xì)研究資料，明確保存液或裂解液等的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗證檢出限和重復(fù)性。

　　提供樣本滅活、處理方式、處理過程的研究。

　　1.2核酸提取和反應(yīng)體系

　　研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取方法與過程、提取用樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

　　提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

　　不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

　　2.樣本穩(wěn)定性

　　對采集后各階段的樣本進(jìn)行穩(wěn)定性研究，包括不同保存液、裂解液，不同滅活方式處理后的樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。

　　建議對每種樣本類型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

　　如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

　　3.適用的樣本類型

　　列明產(chǎn)品適用的樣本類型，如皮膚病變標(biāo)本（包括病變皮疹、痘皰表面和/或滲出物的拭子，痘皰液，痘皰表皮或痘痂等）、咽拭子、全血或血清樣本，應(yīng)分別進(jìn)行分析性能評估。

　　4.核酸提取/純化性能

　　在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。

　　5.精密度

　　應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

　　應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

　　陰性樣本：待測物濃度為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

　　臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

　　中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

　　6.分析特異性

　　6.1交叉反應(yīng)

　　首先應(yīng)采用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行研究，應(yīng)當(dāng)包括人基因組和所有已知病原體。

　　樣本驗證：交叉反應(yīng)研究樣品除特殊說明外，應(yīng)采用滅活的臨床樣本或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

　　6.1.1其他近緣病毒：天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、傳染性軟疣病毒、特納河痘病毒（假病毒）、亞巴猴病毒（假病毒）等。

　　6.1.2引起出疹癥狀等的其他病毒：水痘-帶狀皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒-1/-2、人類皰疹病毒 6、人類皰疹病毒 7、人類皰疹病毒8、麻疹病毒、腸道病毒、梅毒螺旋體、登革病毒等。

　　6.1.3適用樣本中可能存在的其他細(xì)菌/真菌：金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、丙酸桿菌、類白喉桿菌等。

　　6.1.4高濃度人類基因組DNA。

　　注：病毒培養(yǎng)液的濃度單位可采用TCID₅₀或PFU/mL，細(xì)菌培養(yǎng)物濃度單位可采用CFU/mL。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的水平為10⁶CFU/mL或更高，病毒為10⁵PFU/mL或更高。也可采用其他合理方法定值的濃度，例如核酸濃度10⁷copies/mL，如病原體樣本或培養(yǎng)物不能符合上述要求，申請人應(yīng)詳細(xì)說明理由。

　　申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別信息和濃度確認(rèn)等試驗資料。

　　6.2干擾研究

　　6.2.1干擾試驗

　　應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證，驗證推薦物質(zhì)見表1。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的猴痘病毒樣本。對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

表1 用于干擾試驗的物質(zhì)

　　6.2.2競爭性干擾

　　申請人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品適用的樣本類型，充分考慮臨床上容易與猴痘病毒合并感染的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）猴痘病毒核酸檢測的影響，進(jìn)行競爭性干擾研究。

　　7.檢出限

　　7.1檢出限的確定

　　將不同來源的至少3個樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

　　7.2檢出限的驗證

　　選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。

　　如包括多個檢測靶標(biāo)，應(yīng)分別進(jìn)行研究。

　　8.包容性

　　8.1應(yīng)當(dāng)采用生物信息學(xué)分析方法對產(chǎn)品檢測的包容性進(jìn)行研究，應(yīng)當(dāng)包括所有已公布的猴痘病毒核酸序列。

　　8.2驗證具有時間和區(qū)域特征性的至少10個不同來源的陽性樣本，包含西非分支、剛果盆地分支和不同的變異株。研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。

　　9.企業(yè)參考品驗證

　　根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。

　　（五）穩(wěn)定性研究

　　申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計分析結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

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　　陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽性判斷值研究。采用ROC曲線分析建立陽性判斷值，并確定產(chǎn)品的判讀規(guī)則。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

　　如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進(jìn)行陽性判斷值的驗證。

　　提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機(jī)構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

　　提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

　?。ㄆ撸┢渌桥R床研究資料

　　1.主要原材料研究

　　該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

　　1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布猴痘病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的猴痘病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實驗等。

　　1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

　　1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。

　　1.4質(zhì)控品

　　試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備，建議制備濃度為弱陽性。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴(kuò)增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

　　1.5內(nèi)標(biāo)

　　內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

　　1.6企業(yè)參考品制備

　　申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品、精密度參考品。應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗證資料。

　　陽性參考品應(yīng)包含不同濃度水平的目標(biāo)核酸陽性樣本至少5例。

　　陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況，建議包括水痘-帶狀皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒、人類皰疹病毒、天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、化膿性鏈球菌、白色念珠菌等。

　　檢出限參考品應(yīng)包含95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。

　　精密度參考品應(yīng)包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

　　2.生產(chǎn)工藝研究資料

　　介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

　　（八）臨床評價

　　1.臨床試驗機(jī)構(gòu)

　　建議申請人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域選擇臨床試驗機(jī)構(gòu)，應(yīng)是經(jīng)備案的醫(yī)療器械臨床試驗機(jī)構(gòu)（包括各級疾病預(yù)防控制中心）。臨床試驗機(jī)構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

　　2.臨床試驗設(shè)計

　　2.1 與對比方法/試劑的比較研究

　　2.1.1申請人可采用核酸序列測定方法作為參比方法，驗證試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定（測序）結(jié)果之間的一致性。臨床研究中應(yīng)對選用的測序方法做詳細(xì)介紹，并對委托測序服務(wù)的機(jī)構(gòu)（如涉及）資質(zhì)和選擇依據(jù)作簡要說明或提供相關(guān)資料。

　　同時申請人應(yīng)進(jìn)行部分與病毒分離培養(yǎng)鑒定進(jìn)行比對的臨床試驗。

　　2.1.2 如有已上市同類產(chǎn)品，臨床試驗可選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑的選擇應(yīng)考慮樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性。

　　2.2 與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究

　　除上述比對試驗外，還應(yīng)考慮試驗體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)即按照國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《猴痘診療指南》及《猴痘防控技術(shù)指南》等文件進(jìn)行病例診斷的方法。

　　3.臨床試驗入組人群

　　臨床試驗的入組人群應(yīng)為產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為猴痘的疑似病例，申請人在進(jìn)行臨床試驗時應(yīng)依據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《猴痘診療指南》中對“疑似病例”的定義，按照該定義入組病例進(jìn)行臨床研究。同時還應(yīng)入組部分需要進(jìn)行鑒別診斷的其它發(fā)熱出疹性疾病，如水痘、帶狀皰疹、單純皰疹、麻疹、登革熱等進(jìn)行特異性的評價。如試驗體外診斷試劑包括血液樣本類型，應(yīng)注意針對該樣本類型，入組人群應(yīng)為急性期發(fā)病7日內(nèi)的病例。

　　4.臨床試驗樣本類型

　　臨床樣本的采集建議按照《猴痘病毒實驗室檢測技術(shù)指南》進(jìn)行。臨床試驗過程中，如臨床試驗過程中樣本確實難以獲得，經(jīng)提取后的核酸提取液亦可作為樣本進(jìn)行臨床試驗。如采用核酸提取液進(jìn)行臨床試驗，建議臨床試驗中明確該核酸提取液對應(yīng)的樣本類型及樣本保存液/采樣液（如適用），同時明確核酸提取試劑盒，臨床前應(yīng)對臨床試驗中所涉及的樣本類型、樣本保存液及核酸提取試劑進(jìn)行充分的性能評估，臨床試驗中所用樣本保存液及核酸提取試劑應(yīng)嚴(yán)格滿足考核試劑及對比試劑要求。

　　如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，如皮膚病變標(biāo)本（包括皮疹/痘皰滲出物的拭子；痘皰液；痘痂等）、咽拭子、全血或血清樣本，應(yīng)在臨床試驗中分別進(jìn)行臨床評價。針對全血和血清兩種樣本類型，申請人可通過同源比對的方式進(jìn)行評價。樣本類型的選擇，應(yīng)參考國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《猴痘診療指南》及《猴痘防控技術(shù)指南》等文件的相關(guān)要求。

　　5.臨床試驗樣本量

　　與對比方法/試劑比較研究的臨床試驗樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行估算。臨床試驗可依據(jù)試驗用體外診斷試劑相對于對比方法的陰陽性符合率分別估算最低陰陽性樣本例數(shù)。

　　臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計算，

　　公式中，n為樣本量；Z1-α、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P₀為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，P_T為試驗體外診斷試劑評價指標(biāo)預(yù)期值。

　　其中，陰陽性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）建議不低于90%。獲得臨床試驗數(shù)據(jù)后，證明產(chǎn)品相對于對比方法的陰陽性符合率（置信區(qū)間下限）不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P₀）。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

　　如申報試劑包含不同樣本類型，建議針對皮膚病變標(biāo)本、咽拭子、血液樣本分別按照上述方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)估算。皮膚病變標(biāo)本中，皮疹/痘皰滲出物的拭子、痘皰液、痘痂等均應(yīng)有一定例數(shù)。

　　病毒分離培養(yǎng)應(yīng)入組一定數(shù)量的陽性及陰性病例，考察試驗體外診斷試劑與病毒分離培養(yǎng)結(jié)果的一致性，納入的例數(shù)也應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)估算，可采用抽樣精度的公式進(jìn)行樣本量估算。

　　與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究，建議參考與對比方法/試劑比較研究部分的樣本量估算方法，設(shè)定合理的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。

　　6.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

　　此類產(chǎn)品的臨床試驗?zāi)康脑谟隍炞C試驗體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品及臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性，統(tǒng)計分析一般以四格表的形式對結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計算試驗體外診斷試劑與對比方法的陽性/陰性符合率、臨床靈敏度、臨床特異度及其置信區(qū)間。應(yīng)將試驗體外診斷試劑與對比方法檢測結(jié)果一致性、試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性、試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果與病毒分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果的一致性分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，以評價產(chǎn)品臨床性能。

　　臨床試驗建議對入組人群的人口學(xué)進(jìn)行分析，包括年齡、性別、臨床診斷背景等。臨床試驗中包含不同樣本類型的，應(yīng)在總樣本數(shù)（各樣本類型總和）進(jìn)行統(tǒng)計分析的基礎(chǔ)上，每個樣本類型分別進(jìn)行統(tǒng)計分析。

　　臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、疾病轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。

　　7. 境外臨床試驗數(shù)據(jù)的認(rèn)可

　　境外臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結(jié)果影響的論證資料。

　　注冊申請人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數(shù)據(jù)的充分性。

　　8. 臨床證據(jù)的形式要求

　　申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機(jī)構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結(jié)、臨床試驗報告以及臨床試驗數(shù)據(jù)庫。

　　臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表作為臨床試驗報告的附件提交。數(shù)據(jù)表中應(yīng)包括檢測病例的編號、年齡、性別、樣本類型、臨床診斷結(jié)果、發(fā)病時間、試驗體外診斷試劑檢測結(jié)果（含各基因的Ct值）、對比方法的檢測結(jié)果（各基因的Ct值）等，如臨床試驗中所用樣本為核酸提取液，應(yīng)明確該樣本樣本保存液（如涉及）、核酸提取試劑等。臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)集中每一病例編號應(yīng)能夠溯源。

　　關(guān)于測序試驗，申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細(xì)試驗資料，需有臨床試驗單位的簽章確認(rèn)。

　?。ň牛┊a(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

　　產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。新冠病毒核酸檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

　　1.【預(yù)期用途】

　　本試劑盒用于體外定性檢測猴痘疑似病例、其他需要進(jìn)行猴痘病毒感染診斷或鑒別診斷者的xx樣本中猴痘病毒核酸。

　　有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照《猴痘診療指南》及《猴痘防控技術(shù)指南》等文件執(zhí)行。

　　該產(chǎn)品在使用上應(yīng)當(dāng)遵守《猴痘診療指南》及《猴痘防控技術(shù)指南》等文件的相關(guān)要求。

　　開展猴痘病毒核酸檢測，應(yīng)符合《猴痘病毒實驗室檢測技術(shù)指南》等的要求，做好生物安全工作。

　　本試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

　　2.【檢驗原理】

　　簡述產(chǎn)品的核酸提取和擴(kuò)增原理，檢測能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡要描述。

　　3.【主要組成成分】

　　明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑，病毒保存液等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。

　　4.【樣本要求】

　　需詳細(xì)描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，適用的拭子材質(zhì)（如適用），保存液及使用體積、適用的抗凝劑類型（如適用），滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

　　5.【檢驗方法】

　　明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質(zhì)控品與待測樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍，作為實驗有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

　　6.【檢驗結(jié)果的解釋】

　　通過擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、復(fù)測、無效等所有情形。

　　7.【檢驗方法的局限性】

　　7.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

　　7.2有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析

　　7.2.1 如果樣本在運輸、處理過程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

　　7.2.2 實驗環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

　　7.2.3 實驗過程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

　　7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

　　7.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運、儲存及處理、樣本中病原體含量過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

　　7.3.2該病原體待測靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果；

　　7.3.3 未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

　　8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

　　簡述以下性能指標(biāo)：

　　8.1國家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）和企業(yè)參考品的符合率。

　　8.2檢出限：簡要介紹評價方法、所用樣本情況以及評價結(jié)果。

　　8.3對包容性的研究情況進(jìn)行總結(jié)。包括不同分支樣本和猴痘病毒變異株的檢出限和重復(fù)性性能并描述猴痘病毒變異株生物信息學(xué)分析結(jié)果。

　　8.4對精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

　　8.5分析特異性

　　8.5.1交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗證的病原體種類，及有/無交叉反應(yīng)的濃度水平。

　　8.5.2干擾試驗：說明驗證的干擾物質(zhì)種類及有/無干擾反應(yīng)的濃度水平。

　　8.6臨床試驗：簡要介紹試驗方法、受試者及樣本、試驗結(jié)果和結(jié)論等。

　　9.【注意事項】

　　9.1本產(chǎn)品僅用于體外診斷。

　　9.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實驗室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室要求。

　　9.3試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴(yán)格按照說明書操作。因拭子等樣本采集過程及病毒感染過程本身的特點，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來的假陰性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時復(fù)測。

　　9.4生物安全防護(hù)相關(guān)內(nèi)容

　　9.5避免實驗室污染的措施