結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則（2017年第25號）

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結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑
注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是針對結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需闡述具體理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對注冊申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

本指導原則所述結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑是指：利用分子生物學技術，對結核病患者的臨床樣本或培養(yǎng)物樣本中的結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變進行體外定性檢測的試劑。針對該定義，需要強調如下幾點。

1.適用人群為：結核病患者。特別注意的是，對于同一注冊單元內可同時進行結核分枝桿菌復合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結核病患者。

2.適用樣本可為：

2.1痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本；

2.2進行結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測的上述樣本應為結核分枝桿菌復合群陽性的樣本。即：來自結核病患者的、結核分枝桿菌復合群陽性的痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本。

3.結核分枝桿菌復合群陽性的確認方法可為：已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的結核分枝桿菌復合群檢測試劑或臨床普遍認可的結核分枝桿菌復合群鑒定方法（如：結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑或傳統(tǒng)的結核分枝桿菌復合群培養(yǎng)鑒定方法）。

4.對于同一注冊單元內可同時進行結核分枝桿菌復合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，其耐藥基因突變檢測部分適用于本指導原則。

本指導原則所述產品的預期用途可表述為以下三種類型：

1.申報產品可區(qū)分具體突變類型，結果報告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產品可區(qū)分具體突變類型。

2.已知申報產品可檢測的具體突變類型（如：針對具體突變類型設計特異突變探針，從檢驗原理上已知可檢測哪些突變類型），但結果不區(qū)分具體突變類型，結果報告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產品不區(qū)分具體突變類型。

3.某段核酸區(qū)域的突變可導致對某種藥物耐藥，申報產品從檢驗原理上沒有必要明確具體突變類型，結果報告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥，本產品無法明確具體突變類型。

本指導原則的技術要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對于線性雜交或基因芯片等其他核酸檢測技術，可能部分要求不完全適用或本指導原則所述技術指標不夠全面，注冊申請人可根據產品特性選擇合適的方法進行評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證其科學合理性，同時確認性能評價的充分性。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從檢測靶標、方法學及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區(qū)別。若尚無同類產品批準上市，則應提交詳實充分的科學證據，包括：突變區(qū)域、突變類型與結核分枝桿菌復合群表型耐藥的相關性以及突變檢測的臨床意義，證明申報產品的檢測靶標具有明確的臨床意義。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料的研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質量分析和質控標準等相關研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產，其生產工藝必須相對穩(wěn)定，并提交工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應提供的資料包括：供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。

1.核酸分離純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應提交對純度、濃度以及保存穩(wěn)定性等的驗證資料。

2.2引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩(wěn)定性以及功能性實驗等的驗證資料。如為外購，還應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進行標記，并經HPLC或其他適宜方法純化，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜，應對探針的分子量、純度及標記的熒光素進行核實，并進行功能性試驗驗證。

2.4酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。應對酶活性進行合理驗證。

3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）污染。

4.企業(yè)參考品：詳細說明企業(yè)參考品的原料選擇、制備和定值過程等試驗資料。

4.1陽性參考品

應包括申報產品聲稱的全部突變類型。陽性參考品的突變類型需經過金標準方法或已上市同類分型試劑的確認。常見突變類型的陽性參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型的陽性參考品可以采用含有突變的核酸（如：結核分枝桿菌基因組DNA或質粒），不建議采用臨床樣本（如痰液）作為陽性參考品。注冊申請人可根據權威機構的最新文件或文獻等確定常見突變類型，并提交相應的支持資料。

4.2陰性參考品

可采用經確認靶序列未發(fā)生突變的結核分枝桿菌菌株、申報產品聲稱的其他無關突變類型的核酸等。

4.3最低檢測限參考品

最低檢測限參考品須含有聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測限參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

4.4精密度參考品

精密度參考品至少應包括弱陽性（低濃度突變型）水平，須含有申報產品聲稱的所有突變類型。常見突變類型的精密度參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

對于c類預期用途的產品，申請人應盡可能對國內已報告的耐藥核酸區(qū)域內的常見突變類型設置上述各種類型的企業(yè)參考品。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。對于利福平耐藥基因突變檢測試劑，陽性參考品、最低檢測限參考品以及精密度參考品至少應包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對于其他藥物的耐藥基因突變檢測試劑，陽性參考品、最低檢測限參考品以及精密度參考品至少應包括耐藥相關的常見突變類型，并且至少應有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數量可根據申報產品的具體情況而定。

5.試劑盒內的對照

申報產品的質控體系通過設置各種對照來實現(xiàn)，以對樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結果進行合理質控。申報資料應詳細說明各種對照的原料選擇、制備和定值過程等。

本指導原則的技術要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對于采用該方法學的結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑，建議至少設置陽性對照、內對照和陰性對照。

5.1陽性對照

陽性對照可對實驗過程進行質控。陽性對照可采用菌株、質粒或基因組提取物等。企業(yè)應對陽性對照相應判斷數值做出明確要求。

5.2內對照

內對照可對實驗過程的假陰性結果進行質量控制。內對照可采用質?；蚓€性DNA等。申請人應對內對照的引物、探針和模板濃度做精確的驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導致假陰性。企業(yè)應對內對照或相應判斷數值做出明確要求。

5.3陰性對照

陰性對照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白對照，以對交叉污染造成的假陽性結果進行質控。陰性對照需參與樣本核酸的平行提取純化。

由于申報產品所適用的臨床樣本比較復雜，其中可能含有各種影響PCR反應的抑制物，造成假陰性。因此，申報產品應充分考慮對樣本核酸提取純化環(huán)節(jié)的質量控制，通過設置各種對照進行質控。比如，采用克隆菌株作為內對照或陽性對照并參與樣本核酸的平行提取純化，或者設置專門的核酸提取純化對照（如菌株）等，以對樣本核酸提取純化的質量及效率進行評估。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

生產工藝及反應體系的研究資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應條件和質控體系設置等，提供確切的依據，配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率、離子濃度等關鍵參數進行有效控制。主要包括以下內容：

1.主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度以及陽離子濃度等。

3.PCR反應各階段溫度、時間及循環(huán)數的研究資料。

4.對于基線閾值和閾值循環(huán)數等確定的研究資料。

5.如申報產品包含核酸提取純化試劑，應提交對核酸提取純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交對申報產品進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體試驗方法、內控標準、實驗數據和統(tǒng)計分析等詳細資料。該類產品建議著重對以下分析性能進行研究。

1.陽性/陰性參考品符合率

各突變類型的陽性參考品均應檢出陽性/耐藥，陰性參考品應檢測為陰性/敏感。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

2.最低檢測限

建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。擴增反應終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個因素是由臨床樣本中的結核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對比例決定的。因此，需從以下兩個方面考察申報產品的最低檢測限。

2.1 100%耐藥比例下，耐藥菌株/突變核酸的最低檢測濃度

將結核分枝桿菌耐藥菌株/突變核酸進行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株/突變核酸樣本。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有相應突變的核酸樣本（如：質?；蚧蚪MDNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

分別對各濃度樣本進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為可檢測的最低耐藥菌株/突變核酸濃度。

2.2不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。

配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：將不同濃度的結核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進行混合，調整野生和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液?；蛘撸瑢⒉煌瑵舛鹊囊吧|粒和突變質粒進行混合，調整野生質粒和突變質粒的比例，得到含不同核酸濃度和各種耐藥比例的核酸混合液。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本（如：質粒或基因組DNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

對各份混合液進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。

為確定痰樣本的最低檢測限，建議將至少1株結核分枝桿菌耐藥/敏感菌株、結核分枝桿菌陰性的痰樣本進行混合，完全按照申報產品的操作步驟對此“制備痰液”進行樣本前處理、核酸提取純化和擴增等。對結核分枝桿菌陰性痰樣本的確認，應采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測試劑盒進行聯(lián)合確認。

應明確每種菌株/核酸的來源、突變類型、濃度和制備方法等信息。

企業(yè)可采用適宜方法進行菌株濃度的確認，可采用鋪板計數細菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進行菌株濃度的確認，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國家參考品對菌株濃度進行標定，以“個菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。

3.分析特異性

3.1野生型驗證：采用不同濃度的野生型結核分枝桿菌進行驗證，結果應為敏感或陰性。

3.2申報產品聲稱的全部突變類型間的交叉反應驗證。

3.3對于痰等復雜的臨床樣本類型，鑒于可檢測樣本中可能同時含有結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌復合群，為了驗證非結核分枝桿菌復合群等其他病原體對申報產品的檢測結果是否造成假陰性和假陽性結果，需對核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進行交叉反應的驗證。

用于交叉反應研究的其他分枝桿菌具體包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶然分枝桿菌、胃分枝桿菌、胞內分枝桿菌、草分枝桿菌。上述細菌均應進行驗證。

用于交叉反應研究的其他病原體具體包括：肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、隱球菌、金黃色葡萄球菌、諾卡氏菌、綠膿桿菌、白色念珠菌。上述病原體均應進行驗證。

對于培養(yǎng)物樣本類型，3.3項不適用。

4.干擾物質

4.1潛在干擾物質主要包括：內源性物質（不含待檢野生/突變靶標的相應臨床樣本）和外源性藥物。建議使用醫(yī)學相關水平的干擾物濃度進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（最差條件）條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進行干擾驗證。具體目錄參見表3。

用于干擾研究的外源性藥物具體包括：異煙肼、利福平、抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑（如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液）、鼻用軟膏類（如：莫匹羅星）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗病毒藥（如：扎那米韋）、鼻腔糖皮質激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）。上述外源性藥物均應進行驗證，括號內至少選做一種。

對于培養(yǎng)物樣本類型，4.1項不適用。

4.2對于培養(yǎng)物樣本，干擾物質主要為適用培養(yǎng)基和相關藥物的干擾，應在最低檢測限濃度/陰性條件下驗證相關藥物和培養(yǎng)基對檢測結果的影響，明確不產生干擾的最大培養(yǎng)基和藥物濃度。

5.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據不同產品特征或企業(yè)的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考國內或國外的相關文件進行。企業(yè)應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求。針對申報產品的精密度評價主要包括以下要求。

5.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報產品（包括提取純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應對不同的適用機型（如PCR分析儀）、操作者和地點等要素進行相關的驗證。

5.2 合理的精密度評價周期，例如：為期至少12天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

5.3 建議在以下3個濃度進行驗證：

5.3.1陰性樣本：靶序列未發(fā)生突變的結核分枝桿菌野生型菌株，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

5.3.2弱陽性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度略高于申報產品的最低檢測限，陽性檢出率應高于95%（n≥20）。（弱陽性樣本應包括申報產品聲稱的所有突變類型。常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。）

5.3.3中等陽性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度約為最低檢測限的2倍或3倍，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。（可選擇申報產品聲稱的部分突變類型進行驗證，但至少應包括1株結核分枝桿菌耐藥菌株。）

6.不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能資料要求

如果某種樣本類型可采用幾種方法進行樣本前處理（如：痰/痰沉淀物），申請人應提交適用的樣本前處理方法（進行全項目分析性能評估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限項目），以證明不同的樣本前處理方法不影響檢測結果。

如果某種樣本類型可采用幾種方法進行核酸提取純化，申請人應提供適用的核酸提取純化方法（進行全項目分析性能評估的核酸提取純化方法除外）與后續(xù)試驗配合進行的性能試驗（至少包括最低檢測限和精密度項目），以證明不同的核酸提取純化方法不影響檢測結果。

對于c類預期用途的產品，申請人應對國內已報告的耐藥核酸區(qū)域內的常見突變類型進行上述分析性能項目的驗證。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。對于利福平耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗至少應包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對于其他藥物的耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗至少應包括耐藥相關的常見突變類型，并且至少應有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數量可根據申報產品的具體情況而定。

對于適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用儀器】項中所列的所有型號儀器的至少三批全性能評估資料。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值確定資料主要是指Ct值/Ct值的差值/熒光信號差值等的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產品用于結果判斷的臨界值予以確認。有關ROC曲線分析的細節(jié)，請參考國內外相關的文件。如存在灰區(qū)，應提交灰區(qū)上下限確定的詳細研究資料。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報產品的穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩(wěn)定性，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

另外，還應提供樣本保存條件、保存時間等方面的詳細研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸分離純化前樣本穩(wěn)定性和分離純化后核酸在儲備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內選擇多個溫度點（應至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行分析驗證，從而確認不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

（七）臨床試驗研究

1.臨床試驗機構的選擇

申請人應當選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照相關規(guī)定開展臨床試驗。申請人應根據產品特點及其預期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學背景和病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗機構。

2.臨床試驗人群：對于僅進行結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測的單功能試劑，選擇結核病患者進行臨床試驗；對于同一注冊單元內可同時進行結核分枝桿菌復合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結核病患者。

3.臨床樣本的要求：進行結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測的臨床樣本應為結核分枝桿菌復合群陽性的樣本。結核分枝桿菌復合群陽性的確認方法同本指導原則“二范圍”第3條。

4.臨床試驗樣本量

鑒于痰、支氣管肺泡灌洗液以及培養(yǎng)物等樣本之間差異較大，如果申報產品同時適用于上述幾種樣本類型，每種樣本類型的例數不少于500例。

如果申報產品適用于某種樣本類型的液體培養(yǎng)物和固體培養(yǎng)物，應進行不少于150例液體和固體培養(yǎng)物的同源比對試驗（應包括一定數量的陽性和陰性樣本），證明不同的培養(yǎng)物不會影響檢測結果。

如果某種樣本類型適用于幾種樣本前處理方法，應進行不少于150例樣本的同源比對試驗（應包括一定數量的陽性和陰性樣本），證明不同的樣本前處理方法不會影響檢測結果。

如果某種樣本類型適用于幾種核酸提取純化方法，應進行不少于150例樣本的同源比對試驗（應包括一定數量的陽性和陰性樣本），證明不同的核酸提取純化方法不會影響檢測結果。

臨床試驗應盡量采用新鮮樣本，如采用凍存樣本應另行說明。

5.對比試劑

5.1對于已有同類產品上市的申報產品

如果選擇已上市同類產品或基因測序作為對比試劑，還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進行傳統(tǒng)藥敏試驗（金標準）的驗證。

對于c類產品，除了還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進行傳統(tǒng)藥敏試驗（金標準）的驗證外，還需對所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學方法進行驗證，以明確引起耐藥/陽性的具體突變類型。

如果選擇傳統(tǒng)藥敏試驗（金標準）作為對比方法，還需對所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學方法進行驗證，以明確引起耐藥的具體突變類型。

5.2 對于新的結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑

對于新的結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑，選擇傳統(tǒng)藥敏試驗方法（金標準）和基因測序作為對比試劑。

5.3 陽性樣本例數的要求

對于a類和b類產品，產品預期用途中聲稱的每種突變類型均應具有一定的陽性例數，每種突變類型均應分別進行統(tǒng)計分析。對于c類產品，應盡量對檢測靶核酸區(qū)域內的常見突變類型進行驗證。

有關測序方法的相關要求，請參考《結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑技術審查指導原則》相關要求以及現(xiàn)行法規(guī)要求。

6.臨床試驗方法、數據及統(tǒng)計分析

6.1應在臨床試驗方案或者臨床試驗報告中詳細描述申報產品和對比試劑的具體操作步驟。

6.2臨床試驗原始數據應以列表的方式表示，包括樣本的申報產品的結果、對比試劑的結果、藥敏結果以及耐藥比例和臨床診斷（如：何種結核?。┑?。

6.3對臨床試驗數據的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。

6.4對于申報產品與對比試劑（對比方法）的等效性評價，常選擇交叉四格表形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統(tǒng)計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床試驗方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，即評價申報產品與對比試劑（對比方法）是否等效的標準。

6.5結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用金標準（測序或藥敏試驗）或其他合理方法進行復核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。如無需復核，應詳細說明理由。

7.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究者應從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設計科學合理的臨床試驗方案。各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的樣本入選/排除標準，任何已經入選的樣本再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，申報產品的樣本類型不應超越對比試劑對樣本類型的要求。

8.臨床試驗報告的撰寫

根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床試驗報告中對以下內容進行詳述。

8.1臨床試驗總體設計及方案描述

8.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床試驗機構選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

8.1.2病例的納入/排除標準。

8.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存；培養(yǎng)、鑒定、藥敏方法等。結核分枝桿菌復合群陽性的確認方法，如采用已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑作為確認方法，應明確生產廠家和醫(yī)療器械注冊證號等相關信息；如采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法作為結核分枝桿菌復合群陽性的確認方法，應詳細說明培養(yǎng)方法和鑒定方法。

8.1.4統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結果的標準。

8.2具體臨床試驗情況

8.2.1申報產品和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

8.2.2對各試驗機構的病例數等情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

8.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

8.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本的保存條件、結果不一致樣本的校驗等。

8.3統(tǒng)計學分析

8.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或其他合理方法的復核以及是否納入最終數據統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

8.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

8.3.3以交叉表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。

8.4討論和結論

對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床試驗有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

（八）產品說明書

產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的其他注冊申報資料保持一致，如某些內容引自參考文獻，則應采用規(guī)范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對結核分枝桿菌復合群耐藥基因突變檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員合理編制說明書。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

1.1根據【檢驗結果的解釋】的結果報告形式，【預期用途】第一段可表述為以下幾種情況：

1.1.1申報產品可區(qū)分具體突變類型，結果報告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產品可區(qū)分具體突變類型。本產品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結核病的輔助診斷。

1.1.2已知申報產品可檢測的具體突變類型（如：針對具體突變類型設計特異突變探針，從檢驗原理上已知可檢測哪些突變類型），但結果不區(qū)分具體突變類型，結果報告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括zz，本產品不區(qū)分具體突變類型。本產品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結核病的輔助診斷。

1.1.3某段核酸區(qū)域的突變可導致對某種藥物耐藥，申報產品從檢驗原理上沒有必要明確具體突變類型，結果報告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產品用于體外定性檢測來自結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的xx樣本中的yy耐藥，本產品無法明確具體突變類型。本產品用于對某種（類）藥物耐藥的耐藥結核病的輔助診斷。

需要特別注意如下幾點：

1.b類預期用途的試劑所包括的突變類型對同一種（類）藥物必須具有相同的指導用藥的臨床意義。

2.對于c類預期用途的試劑，申請人必須有充分可靠的科學證據證明某段核酸區(qū)域與某種（類）藥物具有明確的臨床意義。申請人必須提供科學權威的支持資料，證明：耐藥基因區(qū)域的突變可引起耐藥；耐藥基因區(qū)域的突變對同一種（類）藥物必須具有相同的指導用藥的臨床意義。申請人還應提交耐藥基因區(qū)域內所有堿基在國內外的突變頻率。

1.2介紹與耐藥相關的檢測靶標、檢測靶標的突變位點和突變類型（如適用）；明確申報產品可檢測的突變類型或耐藥核酸區(qū)域導致的表型耐藥占臨床所有表型耐藥的比例。

1.3適用人群：結核病患者。特別注意的是，對于同一注冊單元內可同時進行結核分枝桿菌復合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結核病患者，但只有核酸陽性才能進行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結核病患者。

1.4明確臨床試驗驗證過的結核分枝桿菌復合群陽性的確認方法的相關信息。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組份，則應在此注明經過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產企業(yè)、產品名稱以及產品貨號和醫(yī)療器械備案號（如有）等詳細信息。

3.【檢驗原理】

3.1對試劑盒檢測靶標以及突變類型（如適用）進行詳細描述（基因名稱和基因位置、靶序列長度、突變類型（如適用）及相關特征等），對試劑盒所用探針、引物、突變或耐藥的判定終點等進行詳細的介紹；對不同樣品反應管組合、對照設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

3.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和凍融次數要求等，應明確具體的儲存條件及有效期。

5.【樣本要求】重點明確以下內容：

5.1臨床樣本的收集：建議參照《臨床技術操作規(guī)范（結核病分冊）》（中華醫(yī)學會編著）或者《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求或國外的同類文件，并詳細描述采樣步驟和注意事項。

5.2臨床樣本的前處理：建議參考《臨床技術操作規(guī)范（結核病分冊）》（中華醫(yī)學會編著）或者《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》（中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法或國外的同類文件，詳細描述具體的前處理方法。

5.3培養(yǎng)物樣本：詳細描述培養(yǎng)鑒定方法，包括：從患者采集的臨床樣本類型、樣本采集后處理、所用培養(yǎng)基、相關藥物和具體操作步驟等、申報產品從培養(yǎng)物中取樣進行檢測的時間點、取樣方法和對培養(yǎng)物樣本的處理等。

5.4樣本的其他處理、運送和保存：明確核酸提取純化前的其他處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限（短期和長期）以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數的限制等。

6.【適用儀器】所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度和空調氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述待測樣本及相關對照核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用）。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6儀器設置（如適用）：特殊參數、探針的熒光素標記情況、對待測突變及內標和其他對照的熒光通道選擇等。

8.【檢驗結果的解釋】

結合陽性對照、陰性對照、內對照、核酸提取純化對照（如適用）、樣本管檢測結果以及已驗證的突變類型與耐藥之間的關系，以列表的形式詳述所有可能出現(xiàn)的結果及相應的解釋。如存在檢測灰區(qū)（如：耐藥不確定等），應詳述對于灰區(qū)結果的處理方式。

9.【檢驗方法的局限性】

9.1申報產品僅對下述突變類型xx進行了驗證。對于c類產品，在此處明確境內臨床試驗做過驗證的突變類型。

9.2 申報產品的檢測結果僅作為初篩結果，僅供臨床參考，用于輔助診斷結核分枝桿菌復合群的耐藥性，不應作為患者耐藥的確診依據。臨床醫(yī)生應結合患者病情、藥物適應癥、療效及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。

9.3本產品僅檢測靶標區(qū)域內突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機制引起的耐藥本產品不能檢出。

9.4本產品不能用于監(jiān)測患者對于抗生素的治療進展以及成功與否，因為經過抗菌治療后，細菌DNA可能仍舊存在。

9.5有關假陰性結果的可能性分析

9.5.1不合理的樣本采集、運送及處理、樣本中細菌含量過低、核酸過度降解或擴增反應體系中靶標濃度低于檢測限均有可能導致假陰性結果。

9.5.2未經驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結果（如有）。

10.【產品性能指標】簡述以下性能指標：

10.1對國家參考品檢測的符合情況，簡要描述采用國家參考品進行檢測的結果（如適用）。

10.2最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結果。重點考慮原始模板中突變序列的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響。

10.3陽性/陰性參考品符合率。

10.4精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結果。

10.5分析特異性

10.5.1野生型驗證：應采用不同濃度的野生型樣本進行驗證，結果應均為陰性。

10.5.2可檢測突變之間的交叉反應：如申報產品可檢測多種突變，還需驗證申報產品聲稱的所有突變類型之間是否存在交叉反應。

10.5.3干擾物質驗證：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響。

10.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結果。

11.【注意事項】應至少包括以下內容：

11.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

（九）產品技術要求

產品技術要求應符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關規(guī)定。申請人應按照《醫(yī)療器械產品技術要求編寫指導原則》的有關要求，編寫產品技術要求，內容主要包含產品性能指標和檢驗方法，并以附錄的形式明確主要原材料、生產工藝及半成品檢定要求。

該類試劑的注冊檢驗主要包括以下性能指標：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度和最低檢測限等。陽性參考品主要考察對申報產品覆蓋范圍內不同突變類型的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報產品的分析特異性進行驗證。

如果申報產品已有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則產品技術要求不得低于國家/行業(yè)標準的要求。

（十）注冊檢驗

根據《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產品應該在具有相應承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構進行連續(xù)3個生產批次樣品的注冊檢驗。對于已有國家標準品/參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應采用相應的國家標準品/參考品進行檢驗，并符合相關要求。對于目前尚無國家標準品/參考品的項目，申請人應建立自己的參考品體系并提供相應的內部參考品。對于c類預期用途的產品，如果沒有國家參考品，注冊檢驗可采用企業(yè)參考品對國內已報告的常見突變類型進行驗證。常見突變類型的確定方法可參考本指導原則的“4.1陽性參考品”。

三、名詞解釋

1.聚合酶鏈式反應 polymerase chain reaction, PCR

聚合酶鏈式反應或多聚酶鏈式反應是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法。由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。

2.熒光探針PCR

在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。

3.分析特異性 analytical specificity

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學相關濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物。

4.精密度 precision

在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

5.最低檢測限 detection limit, limit of detection

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量的最低值。

6.閾值循環(huán)數 cycle threshold, Ct

實時監(jiān)測擴增過程中，反應管內的熒光信號到達指數擴增時經歷的循環(huán)周期數。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環(huán)數則為閾值循環(huán)數（Ct）。

7.內標 internal control在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結果不理想的原因。